Zeitkinetik des mutp53 knock downs in MDAMB231 Zellen

Zur Untersuchung der mutp53-Expression während der frühen Phase des knock downs in MDAMB231 Zellen wurden diese mit dem Expressionsvektor pSuperior.neo.GFP.Br transfiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion wurden die Zellen anhand der GFP-Fluoreszenz mittels FACS isoliert und aus den GFP-positiven Zellen die Gesamt-RNA extrahiert. Die aufgereinigte Gesamt-RNA wurde in cDNA umgeschrieben und mit p53-spezifischen Primern amplifiziert. Eine qualitative Darstellung der Zeitkinetik des mutp53

MDAMB231

MDAMB468

Abbildung 28 FACS Analyse von transfizierten MDAMB231 und MDAMB468 Zellen

24 h nach der Transfektion von 1x 10⁶ Zellen mit pSuperior.neo.GFP.Br bzw pSuperior.neo.GFP.scr wurden die Zellen trypsiniert und in 800 l 4 % FCS in 1x PBS resuspendiert. Der Analyse der Zellen erfolgte im FACS Aria.

knock downs ist in Abbildung 29A illustriert. In MDAMB231 Zellen kommt es innerhalb der ersten 36 Stunden nach der Transfektion mit dem shRNA-exprimierenden Konstrukt zu einer Abnahme des mutp53-Transkripts. Dabei war der transiente knock down 36 Stunden nach Transfektion am effektivsten. Am nächsten Zeitpunkt (48 h) konnte keine abweichende Regulierung der mutp53-Transkripte festgestellt werden.

Abbildung 29 Zeitkinetik des transienten mutp53 knock downs in MDAMB231 Zellen

1x 10⁶ Zellen wurden mit 2 g von pSuperior.neo.GFP.Br bzw. pSuperior.neo.GFP.scr transfiziert und wie vorher beschrieben an unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transfektion sortiert. 100 ng extrahierte RNA wurde in cDNA umgeschrieben (P1Cap-CDS/ poly T-CDS). (A) Spezifische Amplifikation von p53 (TP53_Q1/Q2) und Aktin (Hs-AKTB-A/B) und elektrophoretische Auftrennung im 2 % Agarosegel. (B) relative p53 Expression in der Q-RT-PCR, blau: MDAMB231 transfiziert mit scrambled Konstrukt; rot:

shRNA exprimierende Zellen. Es wurde auf die Transkription von HPRT1 nomalisiert. Zellen, die mit dem scrambled Konstrukt transfiziert wurden, dienten als Referenz (Wert der relativen Expression =1)

Zur Validierung und Quantifizierung dieser Beobachtungen wurde mit der gleichen cDNA eine Q-RT-PCR durchgeführt. Die Ergebnisse der Q-RT-PCR in Abbildung 29B bestätigten die bereits gemachten Beobachtungen zum funktionellen knock down von mutp53 während der ersten 36 Stunden nach Transfektion. Schon nach zwölf Stunden konnte eine deutliche Verringerung der mutp53-Transktipte um fast 50 % detektiert werden. Die größte Reduktion wurde, wie schon vorher gezeigt, am 36 Stunden-Zeitpunkt festgestellt. Hier betrug die mutp53-Expression nur noch etwas über 30 % des Wertes von Zellen, die mit dem scrambled Konstrukt (Referenzzellen) transfiziert wurden. 48 Stunden nach Transfektion der Zellen mit dem shRNA Konstrukt die mutp53-Expression in diesen Zellen leicht über den Wert der Referenzzellen. Am nächsten Zeitpunkt (72 h) fiel der Wert wieder auf den der Referenzzellen.

In MDAMB231 Zellen war es also möglich, transient die mutp53-Expression zu reprimieren.

Der knock down des TP53 Gens konnte schon zwölf Stunden nach Transfektion der shRNA deutlich detektiert werden und war nach ungefähr 48 Stunden nicht mehr vorhanden, obwohl die Anwesenheit des Expressionsvektors anhand der EGFP Expression zu jedem Zeitpunkt nachweisbar war. Jedoch ist hierbei zu beachten, dass die Halbwertszeit des EGFPs bis zu 26 Stunden betragen kann und somit die Fluoreszenz nicht unbedingt die aktive Transkription am Expressionsvektor nachweist.

In RIP Experimenten konnte die Bindung von RNA sowohl an wtp53 als auch an mutp53 in vivo nachgewiesen werden. Im Fall von wtp53 konnte die Assoziation mit der eigene mRNA und der Transkripte der Gene Mdm2 und p21^Waf/Cip1 dargestellt werden. Da wtp53 diese Gene über die spezifische DNA-Bindung transkriptionell reguliert, liegt es nahe, dass ebenso die wtp53/RNA Interaktion einen regulatorischen Effekt auf die Genexpression hat. Der stabile mutp53 knock down mit exogen exprimierter shRNA war in beiden Zelllinien nicht möglich, wobei selbst die unspezifische scrambled shRNA die Vitalität von MDAMB468 Zellen erheblich beeinflusste. Um einen möglichen Einfluss der scrambled-Transkripte auf die mutp53-Expression in MDAMB231 Zellen nachzuweisen, wurden die Daten aus der vorherigen Q-RT-PCR erneut analysiert. Hierbei wurde nun die Expression in nicht transfizierten Zellen als Referenzwert gesetzt. Das Balkendiagramm in Abbildung 30 zeigt die Ergebnisse der Auswertung. An den ersten beiden Punkten der Zeitkinetik konnte mit diesen Parametern ebenfalls eine deutliche Reduktion der mutp53-Transkription in shRNA-transfizierten Zellen detektiert werden. Zellen, die mit dem scrambled Konstrukt transfiziert

wurden, zeigten ebenfalls eine Erniedrigung der mutp53-Expression im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen. Überraschenderweise stieg die mutp53-Expression 36 Stunden nach Transfektion der scrambled Expressionsvektoren auf das 2 fache im Vergleich zu nicht transfizierten MDAMB231 Zellen an. Dieser Anstieg der mutp53-Transkription konnte ebenfalls für Zellen dargestellt werden, die mit dem p53-shRNA Konstrukt transfiziert wurden. Jedoch verlief dieser Anstieg, womöglich durch die funktionelle shRNA bedingt, etwas schwächer. 48 Stunden nach der Transfektion näherte sich der relative Expressionswert wieder dem Wert der Referenzzellen. Weitere 24 Stunden später wurde wiederum eine Reduktion in der p53-Expression durch beide Konstrukte festgestellt.

Das Ziel der mutp53 knock down Experimente war, den Effekt von mutp53 auf das Expressionsmuster von MDAMB231 und MDAMB468 Zellen zu entschlüsseln. Anhand der differentiell exprimierten Gene sollte unter Einbeziehung der Ergebnisse aus ChIP-Seq- und RIP-Experimenten mögliche biologische Funktionen von mutp53 in den Zellen evaluiert werden. Zwar konnte in den Zelllinien MDAMB231 (in Abschnitt 2.7.1 und 2.7.2) und MDAMB468 (in Abschnitt 2.7.1) eine transiente Erniedrigung der mutp53-Expression erreicht werden, ein stabiler knock down des TP53 Gens war jedoch nicht möglich.

Transfizierte MDAMB468 Zellen konnten nicht subkultiviert werden und selektionierte

Abbildung 30 Erneute Analyse der Werte der Q-RT-PCR aus Abb.29

Relative mutp53 Expression in der Q-RT-PCR, blau: MDAMB231 transfiziert mit scrambled Konstrukt;

rot: shRNA exprimierende Zellen. Es wurde auf die Transkription von HPRT1 normiert. Die mutp53 Expression in nicht transfizierten MDAMB231 Zellen (grau) diente als Referenz (Wert der relativen Expression =1).

MDAMB231 Zellen exprimierten, aufgrund des ausbleibenden Einbaus der Expressionskassette, keine shRNA.

In transienten Experimenten mit der Zelllinie MDAMB231 wurde eine Reduktion der mutp53-Transkripte durch die Expression der spezifischen shRNA erreicht. Allerdings führte die Expression der unspezifischen Kontroll-RNA ebenfalls zu einer Deregulierung der mutp53-Expression. Besonders auffällig war, dass unter dem Einfluss der scrambled Sequenz die mutp53-Expression 36 Stunden nach der Transfektion dramatisch anstieg. Daher ist diese Methode zur Analyse des mutp53-abhängigen Expressionsmusters in MDAMD231 und MDAMB468 Zellen eher ungeeignet. Jedoch ergeben sich dadurch neue Einblicke in die funktionelle RNA-Bindung von mutp53: Es scheint, als führte die exogene Expression von kurzen RNA-Molekülen in mutp53-exprimierenden Zellen zu einer Deregulierung der mutp53-Transkription.

3 D ^ISKUSSION

In der vorliegenden Arbeit sollte das DNA-Bindeverhalten von zwei endogen exprimierten p53-Mutanten der Zelllinien MDAMB231 und MDAMB468 untersucht werden. Anhand der identifizierten Bindestellen und aus den Erkenntnissen von Folgeexperimenten sollte die Protein/DNA Interaktion genauer charakterisiert werden und mögliche epigenetische Funktionen der mutp53-Proteine identifiziert werden.

Tatsächlich konnten einige potentielle mutp53-Bindestellen im Genom von MDAMB231 und MDAMB468 Zellen ermittelt werden. Es zeigte sich zudem, dass mutp53, aber auch wtp53, neben der Interaktion mit DNA ebenfalls RNA-Bindungskapazität besitzen. Darüber hinaus wurde in knock down Experimenten veranschaulicht, dass die Erniedrigung der mutp53-Proteinkonzentration mit erheblichen Komplikationen für die Zellen verbunden ist.

Im Folgenden werden die einzelnen Ergebnisse nun genauer diskutiert.

3.1 mutp53 aus MDAMB231 und MDAMB468 Zellen bindet an