C T L A -4 /C D 3 [ % ]
HT1 HT2 HT3 HT4 HT5
HT6 HT7 HT8 HT9 HT10
P<0,05
Ergebnisse
43
0 5 10 15
vor nach 1 2 3
Zeit [Tage]
C T L A -4 /C D 3 [ % ]
HT11 HT12 HT13 HT14 HT2
A
Abbbbiilldduunngg 66
VeVerrllaauuff dederr CCTTLLAA--44--EExxpprreessssiioonn ddeerr CDCD33--ppoossiittiivveenn PBPBLL vovorr uunndd bibiss 33 TTaaggee nnaacchh HyHyppeerrtthheerrmmiieebbeehhaannddlluunngg bbeeii PPaattiieenntteenn mmiitt bbeerreeiittss mmeehhrrffaacchheerr HHyyppeerrtthheerrmmiiee
3
3..33 HHyyppeerrtthheerrmmiiee--PPrroolliiffeerraattiioonnsstteessttss
AuAuss dederr LiLitteerraattuurr wawarr bebekkaannnntt,, dadassss CTCTLLAA--44 nanacchh AkAkttiivviieerruunngg vovonn CDCD44- -popossiittiivveenn ZeZelllleenn veverrssttäärrkktt eexxpprriimmiieerrtt wwiirrdd,, soso dadassss eess trtroottzz seseiinneerr ininhhiibbiittoorriisscchheenn FuFunnkkttiioonn alalss AkAkttiivviieerruunnggssmmaarrkkeerr gegelltteenn kakannnn.. NNaacchh HyHyppeerrtthheerrmmiieebbeehhaannddlluunngg kokommmmtt eses aann TTaagg 6 6 ppoosstt--HHyyppeerrtthheerrmmiiee zzuu eeiinneemm sisiggnniiffiikkaanntteenn AAnnssttiieegg ddeerr CTCTLLAA- -4-4-EExxpprreessssiioonn (s(s.. 3.3.22)).. DiDieess ddeeuutteett alalssoo auauff eieinnee AAkkttiivviieerruunngg ddeerr T-T-ZZeelllleenn hhiinn.. UmUm heherraauusszzuuffiinnddeenn,, obob HyHyppeerrtthheerrmmiiee zuzu eieinneerr StSteeiiggeerruunngg dederr AnAnttiiggeennpprräässeennttaattiioonn unundd ddaammiitt zuzu eieinneerr veverrssttäärrkktteenn T-T-ZZeellllssttiimmuullaattiioonn ffüühhrrtt,, wwuurrddeenn T-T-ZZeelllleenn auauss ddeemm p
peerriipphheerreenn BlBluutt gegessuunnddeerr SpSpeennddeerr iissoolliieerrtt (s(siieehhee 2.2.88..3)3) unundd mimitt ananttiiggeennpprräässeennttiieerreennddeenn ZeZelllleenn veverrsscchhiieeddeenneerr KoKonnzzeennttrraattiioonneenn ststiimmuulliieerrtt ((ssiieehhee 2
2..88..44)).. DaDabbeeii wuwurrddeenn dadass T-T-ZZeellllmmiittooggeenn PHPHAA ((PPhhyyttoohhäämmaagggglluuttiinniinn)) ododeerr didiee A
Annttiiggeennee PPPPDD ((TTuubbeerrkkuulliinn--AAnnttiiggeenn)) bbzzww.. eeiinn ananttiiggeenneerr ExExttrraakktt auauss PPllaassmmooddiiuumm f
faallcciippaarruumm (P(Pff)) eieinnggeesseettzztt.. NaNacchh dederr InInkkuubbaattiioonn mmiitt MMiittooggeenn ododeerr AnAnttiiggeenn w
wuurrddeenn eieinniiggee APAPCC--KKuullttuurreenn eieinneerr HyHyppeerrtthheerrmmiiee auaussggeesseettzztt,, bebevvoorr ddiiee T-T-ZZeelllleenn hihinnzzuuggeeffüüggtt wuwurrddeenn.. DDiiee SSttiimmuullaattiioonn unundd PrProolliiffeerraattiioonn((ssmmeessssuunngg)) wwuurrddee ddaannnn,, w
wiiee inin 2.2.88..44 bebesscchhrriieebbeenn,, dduurrcchhggeeffüühhrrtt.. DaDabbeeii wuwurrddee jejewweeiillss eieinnee PlPlaattttee reregguulläärr übübeerr ffüünnff TaTaggee bebeii 3737°°CC iinnkkuubbiieerrtt unundd didieennttee alalss KoKonnttrroollllppllaattttee ((AAnnssaattzz 1)1).. DiDiee
Ergebnisse
44
APAPCC dederr zwzweeiitteenn PlPlaattttee wuwurrddeenn vovorrhheerr nonocchh ffüürr eeiinnee SSttuunnddee bbeeii 4141,,88°°CC iinnkkuubbiieerrtt,, umum ddiiee HyHyppeerrtthheerrmmiiee zzuu sisimmuulliieerreenn ((AAnnssaattzz 2)2).. DDiiee VeVerrssuucchhee wuwurrddeenn zwzweeiimmaall dudurrcchhggeeffüühhrrtt ((VVeerrssuucchhssrreeiihhee 1 1 uunndd 2)2)..
AnAnttiiggeennpprräässeennttiieerreennddee ZeZelllleenn mimitt PHPHAA ododeerr dedemm ExExttrraakktt auauss PlPlaassmmooddiiuumm fafallcciippaarruumm bzbzww.. PHPHAA (i(inn eeiinneemm dederr bebeiiddeenn ExExppeerriimmeennttee)) ssttiimmuulliieerrtteenn ddiiee T-T -ZeZelllleenn zzuurr PPrroolliiffeerraattiioonn.. EiEinnee vovorraannggeehheennddee EErrwwäärrmmuunngg auauff HyHyppeerrtthheerrmmiiee- -tetemmppeerraattuurreenn ststeeiiggeerrttee didiee akakttiivviieerreennddee WiWirrkkuunngg ninicchhtt,, eehheerr wawarr teteiillwweeiissee sosoggaarr eieinnee InInhhiibbiittiioonn dederr PPrroolliiffeerraattiioonn zuzu bebeoobbaacchhtteenn (A(Abbbb.. 77--1144)).. LeLeddiigglliicchh uunntteerr PPHHAA- -ZuZussaattzz wawarr iimm erersstteenn VeVerrssuucchh uunntteerr HyHyppeerrtthheerrmmiiee eieinnee PPrroolliiffeerraattiioonnsssstteeiiggeerruunngg imim VVeerrgglleeiicchh zuzurr NiNicchhtt--HHyyppeerrtthheerrmmiieebbeehhaannddlluunngg zzuu ererkkeennnneenn (A(Abbbb.. 1010)),, jejeddoocchh kekeiinnee RReepprroodduuzziieerrbbaarrkkeeiitt bbeeiimm zzwweeiitteenn VVeerrssuucchh ((AAbbbb.. 1144))..
ImIm FoFollggeennddeenn fifinnddeenn sisicchh didiee grgraapphhiisscchheenn AuAusswweerrttuunnggeenn dederr erersstteenn V
Veerrssuucchhssrreeiihhee::
0 5 10 15 20 25 30
keine Zellen 0,3x104
0,6x104 1,25x104
2,5x104 5x104
Proliferation [Zerfälle/min]
37°C 41,8°C
A
Abbbbiilldduunngg 77:: VVeerrssuucchh 11 oohhnnee ZZuussaattzz
AnAnssaattzz 1 1 (b(bllaauu)):: 3377°°CC InInkkuubbaattiioonnsstteemmppeerraattuurr (P(Prroolliiffeerraattiioonnssmmeessssuunngg iinn [
[ZZeerrffäällllee//mmiinn]]))
AnAnssaattzz 22 ((vviioolleetttt)):: mmiitt eeiinnssttüünnddiiggeerr VVoorr--IInnkkuubbaattiioonn bbeeii 4411,,88°°CC,, aannsscchhlliieeßßeenndd 3377°°CC InInkkuubbaattiioonnsstteemmppeerraattuurr ((PPrroolliiffeerraattiioonnssmmeessssuunngg iinn [[ZZeerrffäällllee//mmiinn]]))
DiDiee AAnnggaabbee ddeerr aannsstteeiiggeennddeenn ZZeellllzzaahhlleenn ddeerr xx--AAcchhssee bbeezziieehhtt ssiicchh aauuff ddiiee AAPPCC (E(E--).).
Ergebnisse
45
0 5 10 15 20 25 30
keine Zellen 0,3x104
0,6x104 1,25x104
2,5x104 5x104
Proliferation [Zerfälle/min]
37°C 41,8°C
AbAbbbiilldduunngg 88:: VVeerrssuucchh 11 mmiitt PPPPDD--ZZuussaattzz
0 50 100 150 200 250 300
keine Zellen 0,3x104
0,6x104 1,25x104
2,5x104 5x104
Proliferation [Zerfälle/min]
37°C 41,8°C
AbAbbbiilldduunngg 99:: VVeerrssuucchh 11 mmiitt PPff--ZZuussaattzz
0 200 400 600 800 1000
keine Zellen 1,25x104
Proliferation [Zerfälle/min]
37°C 41,8°C
A
Abbbbiilldduunngg 1100:: VVeerrssuucchh 11 mmiitt PPHHAA--ZZuussaattzz
ImIm FoFollggeennddeenn fifinnddeenn sisicchh ddiiee grgraapphhiisscchheenn AuAusswweerrttuunnggeenn ddeerr zwzweeiitteenn VeVerrssuucchhssrreeiihhee::
Ergebnisse
46
0 1020 3040 5060 7080
keine Zellen 0,3x104
0,6x104 1,25x104
2,5x104 5x104
Proliferation [Zerfälle/min]
37°C 41,8°C
AbAbbbiilldduunngg 1111:: VVeerrssuucchh 22 oohhnnee ZZuussaattzz A
Annssaattzz 1 1 (b(bllaauu)):: 3377°°CC InInkkuubbaattiioonnsstteemmppeerraattuurr (P(Prroolliiffeerraattiioonnssmmeessssuunngg iinn [Z[Zeerrffäällllee//mmiinn]]))
AnAnssaattzz 22 ((vviioolleetttt)):: mmiitt eeiinnssttüünnddiiggeerr VVoorr--IInnkkuubbaattiioonn bbeeii 4411,,88°°CC,, aannsscchhlliieeßßeenndd 3377°°CC InInkkuubbaattiioonnsstteemmppeerraattuurr ((PPrroolliiffeerraattiioonnssmmeessssuunngg iinn [[ZZeerrffäällllee//mmiinn]]))
DiDiee AAnnggaabbee ddeerr aannsstteeiiggeennddeenn ZZeellllzzaahhlleenn ddeerr xx--AAcchhssee bbeezziieehhtt ssiicchh aauuff ddiiee AAPPCC (
(EE--).).
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
keine Zellen 0,3x104
0,6x104 1,25x104
2,5x104 5x104
Proliferation [Zerfälle/min]
37°C 41,8°C
AbAbbbiilldduunngg 1122:: VVeerrssuucchh 22 mmiitt PPPPDD--ZZuussaattzz
0 100 200 300 400 500
keine Zellen 0,3x104
0,6x104 1,25x104
2,5x104 5x104
Proliferation [Zerfälle/min]
37°C 41,8°C
AbAbbbiilldduunngg 1133:: VVeerrssuucchh 22 mmiitt PPff--ZZuussaattzz
Ergebnisse
47
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
keine Zellen 1,25x104
Proliferation [Zerfälle/min]
37°C 41,8°C
AbAbbbiilldduunngg 1144:: VVeerrssuucchh 22 mmiitt PPHHAA--ZZuussaattzz
3
3..44 EEnnttwwiicckklluunngg eeiinneess VeVerrffaahhrreennss zuzurr auauttoommaattiisscchheenn QuQuaannttiiffiikkaattiioonn CTCTLLAA- -4
4--ppoossiittiivveerr ZZeelllleenn
DiDiee bibissllaanngg gegewwäähhllttee sesehhrr susubbjjeekkttiivvee AuAusszzäähhlltteecchhnniikk CTCTLLAA--44--ppoossiittiivveerr ZeZelllleenn sosollllttee auauttoommaattiissiieerrtt unundd obobjjeekkttiivviieerrtt wewerrddeenn.. DiDieess sosollllttee mimitttteellss eieinneess cocommppuutteerrggeessttüüttzztteenn VeVerrffaahhrreennss ererffoollggeenn.. WWiirr wäwähhlltteenn hihieerrzzuu dadass PrProoggrraammmm A
Addoobbee PhPhoottoosshhoopp,, ddaass didiee AAnnzzaahhll flfluuoorreesszziieerreennddeerr ObObjjeekkttee unundd ihihrree F
Flluuoorreesszzeennzziinntteennssiittäätt aannggeebbeenn kakannnn..
3.3.44..11 VVoorraarrbbeeiitteenn
Z
Zuunnääcchhsstt wuwurrddee dadass VVeerrffaahhrreenn ddeerr FlFluuoorreesszzeennzziinntteennssiittäättssmmeessssuunngg mimitthhiillffee vovonn flfluuoorreesszziieerreennddeenn KaKalliibbrriieerruunnggssbbeeaaddss ggeesstteesstteett.. DiDiee BBeeaaddss wawarreenn grgröößßeennhhoommooggeenn unundd enentthhiieelltteenn veverrsscchhiieeddeennee MeMennggeenn eieinneess FFlluuoorreesszzeennzzffaarrbbssttooffffss.. DiDiee MeMennggeennvveerrhhäällttnniissssee wawarreenn bbeekkaannnntt uunndd vavarriiiieerrtteenn uumm eieinneenn FaFakkttoorr vovonn bibiss zuzu 303000.. JJeeddee MeMessssuunngg wwuurrddee ddrreeiimmaall wiwieeddeerrhhoolltt ((aauussffüühhrrlliicchhee DaDatteenn s.s. AnAnhhaanngg)).. DDiiee MiMitttteellwweerrttee ddeerr gegemmeesssseenneenn FlFluuoorreesszzeennzziinntteennssiittäätteenn veverrhhaalltteenn sisicchh prprooppoorrttiioonnaall zuzurr MeMennggee dedess ininkkoorrppoorriieerrtteenn FlFluuoorreesszzeennzzffaarrbbssttooffffss (A(Abbbb.. 1155 unundd 1616)).. DiDieess gigilltt glgleeiicchheerrmmaaßßeenn füfürr ddiiee bebeiiddeenn gegetteesstteetteenn KaKalliibbrraattiioonnssffaarrbbssttooffffee IInnSSppeecckk GGrreeeenn unundd InInSSppeecckk RReedd.. PPrriinnzziippiieellll erersscchheeiinntt ddiieessee MeMetthhooddee alalssoo ffüürr didiee QQuuaannttiiffiizziieerruunngg dederr FlFluuoorreesszzeennzz--mmaarrkkiieerrtteerr ZZeelllleenn auauff eeiinneemm ObObjjeekkttttrrääggeerr ggeeeeiiggnneett zuzu sseeiinn..
Ergebnisse
48
Graph InSpeck Kalibrationsfarbstoff Green
Kit-Fluoreszenzintensität [%]
0 20 40 60 80 100
Average
0 20 40 60 80 100 120
AbAbbbiilldduunngg 1515:: BeBerreecchhnnuunngg dederr FFlluuoorreesszzeennzziinntteennssiittäätt veverrsscchhiieeddeenneerr K
Koonnzzeennttrraattiioonneenn ddeess KKaalliibbrraattiioonnssffaarrbbssttooffffss GGrreeeenn
DiDiee KKoonnzzeennttrraattiioonn ddeess ggrürünneenn FFlluuoorreesszzeennzzffaarrbbssttooffffss ((EExxttiinnkkttiioonnsswweelllleennlläännggee 550055,, EmEmiissssiioonnsswweelllleennlläännggee 515155,, enenttsspprriicchhtt FIFITTCC)) isistt prprooppoorrttiioonnaall zuzurr ggeemmeesssseenneenn FlFluuoorreesszzeennzziinntteennssiittäätt..
InIn dederr GrGraapphhiikk isistt leleiicchhtt zzuu ererkkeennnneenn,, dadassss ssiicchh dadass BiBilldd eieinneerr GGeerraaddeenn ererggiibbtt.. EsEs hahannddeelltt sisicchh alalssoo nnaahheezzuu umum eeiinnee lilinneeaarree AAbbhhäännggiiggkkeeiitt dedess AvAveerraaggee--WWeerrtteess vovonn dederr FlFluuoorreesszzeennzziinntteennssiittäätt.. DiDiee ererrreecchhnneettee FuFunnkkttiioonn dederr idideeaalleenn GGeerraaddeenn vovomm 3%3% zuzumm 110000%%--WWeerrtt llaauutteett:: f(f(xx))== 00,,884411xx ++ 33,,000011
FlFluuoorreesszzeennzzeenn ununtteerrhhaallbb eieinneerr FaFarrbbssttooffffkkoonnzzeennttrraattiioonn vovonn 3%3% wawarreenn ninicchhtt memessssbbaarr..
FüFürr ddeenn KKaalliibbrraattiioonnssffaarrbbssttooffff InInSSppeecckk RReedd eerrggiibbtt sisicchh ununtteerr gglleeiicchheenn BBeeddiinngguunnggeenn eieinnee äähhnnlliicchheerr GrGraapphh ((aauussffüühhrrlliicchhee DaDatteenn ss.. AAnnhhaanngg))::
Ergebnisse
49
Graphik InSpeck Kalibrationsfarbstoff Red
Kit-Fluoreszenzintensität [%]
0 20 40 60 80 100
Average
0 20 40 60 80 100 120
AAbbbbiilldduunngg 1166:: BeBerreecchhnnuunngg dederr FlFluuoorreesszzeennzziinntteennssiittäätt veverrsscchhiieeddeenneerr KoKonnzzeennttrraattiioonneenn ddeess KKaalliibbrraattiioonnssffaarrbbssttooffffss RReedd
D
Diiee KKoonnzzeennttrraattiioonn dedess rrootteenn FlFluuoorreesszzeennzzffaarrbbssttooffffss (E(Exxttiinnkkttiioonnsswweelllleennlläännggee 585800,, EmEmiissssiioonnsswweelllleennlläännggee 606055,, enenttsspprriicchhtt TRTRIITTCC)) isistt pprrooppoorrttiioonnaall zuzurr gegemmeesssseenneenn F
Flluuoorreesszzeennzziinntteennssiittäätt..
InIn dederr GrGraapphhiikk ererggiibbtt sisicchh dadass BiBilldd eieinneerr GGeerraaddeenn mmiitt eeiinneerr lilinneeaarreenn AbAbhhäännggiiggkkeeiitt dedess AvAveerraaggee--WWeerrtteess vovonn dederr FlFluuoorreesszzeennzziinntteennssiittäätt.. DDiiee ererrreecchhnneettee FuFunnkkttiioonn dederr idideeaalleenn GGeerraaddeenn vvoomm 33%% zzuumm 110000%%--WWeerrtt llaauutteett:: ff((xx))== 0,0,887766xx ++ 44,,774422
FlFluuoorreesszzeennzzeenn ununtteerrhhaallbb eieinneerr FaFarrbbssttooffffkkoonnzzeennttrraattiioonn vovonn 3%3% wawarreenn ninicchhtt memessssbbaarr..