Die unter Kapitel 2.3 isolierten und unter 2.4 lyophilisierten Thylakoidmembranen wurden im Folgenden als biologische Einheit des Chloroplasten-Thylakoid-Biosensors (CT-Biosensor) verwendet, um Substanzen nachzuweisen, die st…rende Wirkung auf den photosynthetischen Elektronentransport (PET) besitzen. Eine Hemmung des PET kann •ber drei verschiedene Mechanismen erfolgen:
Hemmung der Plastochinon-Reduktion: Klassische und h€ufigste Herbizid-Hemmung, verursacht durch Bindung eines Hemmstoffes an der QB-Bindenische des D1-Proteins im PS II. Durch die Lage des D1-Proteins in der Lipidmembran m•ssen die entsprechenden Hemmstoffe eine lipophile Eigenschaft besitzen.
Plastohydrochinon-Oxidation: Hemmung des PET, die durch Blockade der R•ckoxidation von PQH2 am Cytochrom-b/f-Komplex entsteht, in vivo aber nicht von Bedeutung ist.
PSI-Elektronenƒbertragung: Durch Reduktion der Hemmstoffe am PS I zu radikalischen Stoffen und der anschlie†enden Elektronen•bertragung auf Sauerstoff entstehen Superoxid-Anionen (O2
-)
Mittels der hier angewendeten PAM-Technik k…nnen allerdings nur die Hemmungen des PET, die dem ersten Hemm-Typus entsprechen, nachgewiesen werden, da nur diese zu
„nderungen in den Fluoreszenzen f•hren (s. 2.5.1)
2.5.1 Prinzip der Messung
Dieser Biosensor dient dazu, Substanzen, die st…rend in die photosynthetische Elektronentransportkette eingreifen, zu detektieren. Hierbei wird das Ph€nomen ausgenutzt, dass in intakten Pflanzen nicht alle Energie, die vom Chlorophyll bzw. Light Harvesting Complex aufgenommen wird, in die photosynthetische Elektronentransportkette weitergeleitet wird. Ein Teil dieser Energie wird auch in Form von W€rme- oder Fluoreszenzstrahlung abgegeben. Im Allgemeinen handelt es sich hierbei um eine „Eigenschutzreaktion“ des Chlorophylls, welches im angeregten Zustand, also im ersten Singulett-Zustand, sehr instabil ist (Sitte et al., 1992). Mit Hilfe der Puls-Amplituden-Modulations-(PAM)-Technik (Schreiber und Bilger, 1993) ist es m…glich, diese Fluoreszenz als Gr…†e zu bestimmen.
In den vorliegenden Untersuchungen wurde das ToxY-PAM-Fluorometer der Firma Walz (Effeltrich, Deutschland) verwendet. Die Fluoreszenz-Anregung und -Messung erfolgt nach dem Prinzip der Puls-Amplituden-Modulation (Bradbury und Baker, 1981; Schreiber, 1986) bei einer Wellenl€nge von 655 nm, also im Bereich des Absorptionsmaximums f•r Chlorophyll a in Ether (662 nm nach Sitte et al., 1994). F•r die Signaldetektion der Fluoreszenz ist im Ger€t intern ein Filter eingebaut, der Fluoreszenz-Messungen erst oberhalb von 690 nm erlaubt. Hierdurch wird verhindert, dass es bei der relativen N€he von Anregungslicht und Fluoreszenzmaximum (670 nm) zu einer ‚berlagerung der Lichtsignale von Anregung und Emission kommt (Popp, 2003).
Das Standard-Fluorometer ToxY-PAM mit Blaulicht (Anregungswellenl€nge 460 nm, Lichts€ttigende Blitze 480 nm und Signaldetektion > 640 nm) konnte nicht verwendet werden, da durch die zu erwartenden F€rbungen der Bodenextrakte im Bereich von leicht gelb bis stark braun als Komplement€rfarbe zum Anregungslicht Filtereffekte zu erwarten waren, die nicht kompensierbar sind. Somit war das „rote“ ToxY-PAM/R mit Rotlichtanregung trotz des geringeren Messfensters dem „blauen“ ToxY-PAM vorzuziehen.
Die Aktivit€t der photosynthetischen Elektronentransportkette wird durch die Messung der Fluoreszenz bei geringem Anregungslicht sowie der Messung der Chlorophyll-Fluoreszenz unter lichts€ttigenden Bedingungen ermittelt (Formel 2.1). Je st€rker eine Substanz in den Elektronentransport eingreift und diesen hemmt, desto st€rker steigt die Fluoreszenz des Chlorophylls in Folge der Eigenschutzreaktion an. Daraus ergibt sich, dass der Yield als Quotient von Fluoreszenz bei Anregungslicht und Fluoreszenz unter lichts€ttigenden Bedingungen kleiner wird, bis er im Falle einer v…lligen Hemmung den Wert
„0“ erreicht, wenn Ft und FmŒ sich entsprechen. Ein weiterer Vorteil ergibt sich durch die Verwendung des Yield, und zwar erreicht man durch die Quotientenbildung, dass der ermittelte Messwert unabh€ngig von der Chlorophyllmenge ist, die sich als Stellgr…†e von FmŒ und Ftin diesen Werten wiederfinden l€sst.
Als Vergleichsmessung in dieser Arbeit diente eine finale Konzentration von 1,25 Žg Diuron/l in der Messkammer.
2.5.2 Durchf€hrung der Messung
F•r die Messungen stehen bei den Chlorophyll-Fluorometern der ToxY-PAM-Reihe zwei Messkan€le zur Verf•gung, die die parallele Betrachtung von Probe und der dazu geh…rigen Kontrolle erlauben. Dies verhindert, dass Schwankungen in der Aktivit€t der biologischen Einheit zwischen zwei zeitlich aufeinander folgenden Messungen einen Einfluss auf das Messergebnis haben. Auch wird durch die parallele Messung von Probe und Kontrolle der zeitliche Aufwand minimiert. Der Aufbau einer Messkammer ist schematisch in Abbildung 2.1 dargestellt. Ersichtlich ist daraus die seitliche Beleuchtung der Probe durch die ringf…rmig angeordneten LEDs, welche auf das Zentrum der Messkammer fokussiert sind. Der Fluoreszenz-Detektor befindet sich am Boden der Messkammer (Popp, 2003; Walz, 2003).
Abb. 2.1:Schematischer Aufbau einer ToxY-PAM-Messkammer.
F•r die Messungen wurden Quarzglas-K•vetten (Hellma, M•llheim/Baden) verwendet. Um unterschiedliche Behand-lungen der angefertigten Ans€tze (Probe und Kontrolle) zu verhindern, war es neben der parallelen Befolgung eines genauen Pipettierschemas n…tig, beide Ans€tze einer unkontrollierten Lichtexposition soweit m…glich zu entziehen. Hierf•r diente eine spezielle Anfertigung aus schwarzem Kunststoff, in welche die K•vetten vor dem Bef•llen gestellt wurden. Die Halterung war in der Art gestaltet, dass der mit Probe, Messpuffer und Thylakoid-Suspension zu bef•llende Bereich in einem dunklen Raum vor Licht gesch•tzt wurde.
Um Temperaturunterschiede zu vermeiden, wurden alle verwendeten L…sungen zwischen den Messungen auf Eis gestellt. Auch konnten dadurch temperaturbedingte Unterschiede in der Fluoreszenz (Agati et al., 2000) vermieden werden.
Substanz Molaritƒt
KH2PO4 500 mM
K2HPO4 1.500 mM
NaCl 400 mM
NH4Cl 80 mM
Flavinmononukleotid (FMN) 0,5 mM
MgCl2x 6H2O 10 mM
pH (KOH) 7,5
Tab. 2.6:Zusammensetzung des bei den PAM-Fluoreszenz-Messungen an den isolierten Thylakoidmembranen zur Aktivit€tsbestimmung des photosynthetischen Elektronentransports verwendeten Messpuffers nach Schnabl und Youngmann, (1987) modifiziert nach Bausch-Weis (1994).
Die Bef•llungen von Probe und Kontrolle entsprachen den Angaben in Tabelle 2.7, wobei die Reihenfolge der angegebenen Schritte unbedingt eingehalten und auf einen gleichm€†igen Ablauf des Ansetzens geachtet werden musste, um m…glichst standardisierte Bedingungen zu gew€hrleisten. Zu diesem Zweck wurden alle Schritte zuerst f•r die Kontrolle, dann f•r die Probe durchgef•hrt, bevor der n€chste Schritt abgearbeitet wurde. Besonders in den Schritten
4-6 war auf Gleichm€†igkeit zwischen den einzelnen L€ufen zu achten, da nach Zugabe der Thylakoid-Suspension in den Ansatz eine Reaktion von Testsubstanz mit der biologischen Einheit bereits einsetzt.
Gesamtvolumen in den Messk€vetten 3.000 †l
Pipetierschritt Kontrolle Probe
1. Wasser 1.500 Žl dest. Wasser 2. L‚sungsmittel 750 Žl L…sungsmittel der
Probe
750 Žl Probe (Boden/TNT-Standard) in entsprechendem L…sungsmittel
3. Puffer 25 Žl Messpuffer (Tab. 2.6) 4. Thylakoide 25 Žl Thylakoid-Suspension 5. Auff€llen 700 Žl dest. Wasser
6. Mischen Mehrmaliges kurzes Resuspendieren des Ansatzes zum Mischen
Tab. 2.7:Aufstellung der Probenzusammensetzung f•r die PAM-Fluoreszenz-Messungen mit dem ToxY-PAM in der durchzuf•hrenden Reihenfolge.
Der benutzte Messpuffer (Tab. 2.6) enth€lt neben den Puffersubstanzen auch den artifiziellen Elektronenakzeptor FMN, der das bei der Thylakoid-Isolation ausgewaschene NADP+ersetzt (Bausch-Weis et al., 1994). Anschlie†end an Schritt 6 wurden beide K•vetten gleichzeitig der
„Ansetzvorrichtung“ entnommen, gleichzeitig in die jeweiligen Kan€le des Fluorometers eingesetzt und gleichzeitig mit lichtundurchl€ssigen Kappen •berdeckt. Unmittelbar darauf wurde die Messreihe gestartet. Eine Messreihe bestand aus sieben Einzelmessungen im Abstand von je einer Minute. Die Gesamtzeit einer Messreihe lag somit bei 6 min. Die Hemmung der Probe wird durch die Steuerungssoftware (ToxY-WIN 1.13) intern anhand der Aktivit€ten (Yield) beider Kan€le gem€† Formel 2.2 in ein prozentuales Verh€ltnis gesetzt (Hemmung der Probe im Vergleich zur Kontrolle). ,
X = (YieldProbe/YieldKontrolle) x 100 Formel 2.2
mit X = Hemmung des PET der Probe im Vergleich zur Kontrolle; YieldProbe= Aktivit€t des PET der Probe;
YieldKontrolle= Aktivit€t des PET der Kontrolle.
Der Messwert einer jeden Reihe wurde im Folgenden aus dem Mittelwert der einzelnen Messpunkte berechnet. Bei der Berechnung wurden die Messpunkte 1-3 einer jeden Messung ausgeschlossen, da die in diesem Zeitraum ablaufende Zeit n…tig ist, um eine gleichm€†ige Durchmischung der Suspension sowie eine ausreichende Einwirkzeit der Probe auf die
biologische Einheit und damit reproduzierbare Messwerte zu gew€hrleisten. Des Weiteren unterliegt die erste Messung trotz allen erw€hnten Ma†nahmen einer hohen Schwankung, die systembedingt nicht ausgeschaltet werden konnte.