4.2 B IOSENSORISCHE D ETEKTION VON TNT
4.2.1 Einfluss der Extraktionsbedingungen f•r die Herstellung von biosensorisch verwendbaren
Eigenschaften der Nitroaromaten best€tigt (Breitmaier und Jung, 1986). Somit w€re die Grundlage f•r eine Elektronen•bernahme in der Thylakoidmembran gegeben.
Das Auftreten einer „nderung der Fluoreszenz spricht weiter daf•r, dass unabh€ngig vom Wirkmechanismus eine Wirkstelle von TNT und seiner Metabolite im Bereich des PS II liegen muss, da das PS I essenziell nicht fluoresziert (Schreiber et al., 1994). Somit l€sst sich eine Funktion der Nitroaromaten als artifizieller Elektronenendakzeptor am PS I zwar, wenn vorhanden, nicht fluorometrisch messen, dennoch liegt zumindest ein Wirkort der Nitroaromaten im Bereich des PS II, womit hier die Beeinflussung detektierbar ist.
Abschlie†end ist davon auszugehen, dass unabh€ngig welcher Wirkmechanismus vorliegt, die Festlegung der Lichtenergie in Form von NAPH+H+ sowohl durch Diuron wie auch durch nitroaromatische Verbindungen stark beeinflusst wird.
bei Podola und Melkonian. (2003) beschrieben, wobei gleicher Nachweis auch auf der Basis der hier verwendeten Puls-Amplituden-Modulations-Technik durchgef•hrt wurde (Podola et al., 2004).
Dennoch wurde versucht, in dieser Arbeit ein Extraktionsverfahren zu entwickeln, welches einen m…glichst guten Kompromiss zwischen TNT-L…slichkeit, biosensorischer Vertr€glichkeit und Reproduzierbarkeit der Messungen gew€hrleistet.
Um TNT also in sp€teren Messungen gut messen zu k…nnen und um eine L…slichkeit in f•r die Messungen ausreichenden Konzentrationen zu erhalten, wurde die Wirkung von organischen L…sungsmitteln auf den CT-Biosensor untersucht. Nach Taha et al.(1997) besitzt TNT eine L…slichkeit von 1.000 g/l in Acetonitril. Dies sprach zwar f•r Acetonitril als gutes L…sungsmittel f•r TNT, aber wie in Tabelle 3.6 dargestellt, war die Beeinflussung des CT-Biosensors durch 10 % Acetonitril mit 87,262 % (+/-4,918 % SD) zu hoch, um nitroaromatische Verbindungen nachweisen zu k…nnen. Abbildung 4.1 stellt in diesem Zusammenhang graphisch dar, wie weit sich der Messbereich durch eine 10%ige Acetonitril-Zugabe in der Kontrolle einschr€nken w•rde.
Beeinflussung des CT-Biosensors durch Verwendung von 10 % Acetonitril als L•sungsmittel im Vergleich zu w€ssrigen L•sungen
0 20 40 60 80 100
Kontrolle/Wasser Probe mit 50%iger Hemmwirkung
Kontrolle in 10 % Acetonitril
Probe mit 50%iger Hemmwirkung in 10 %
Acetonitril
Aktivit€t des photosynthetischen Elektronentransports in Prozent
50%
50%
Abb. 4.1.: Darstellung der Beeinflussung des Chloroplasten-Thylakoid-Biosensors durch 10 % Acetonitril als L…sungsmittel im Vergleich zu w€ssrigen L…sungen anhand der Gegen•berstellung der Kontrollen sowie einer theoretischen Probe mit 50 % Hemmwirkung.
Die blauen S€ulen geben in diesem Zusammenhang die Kontrolle einer reinen Wasser-L…sung neben einer Probe mit 50%iger Hemmungswirkung an. Die orangen S€ulen stellen die gleiche theoretische Messung dar, jedoch mit zus€tzlich 10 % Acetonitril in Probe und Kontrolle.
Aus der Graphik wird deutlich, dass Messungen in einem solch stark eingeschr€nkten Messbereich kaum Spielraum f•r den Nachweis von Hemmstoffen des PET bzw. f•r Messungen unterschiedlicher Konzentrationen bieten, wodurch Acetonitril als L…sungsmittel nicht angewendet werden konnte.
Auch die Betrachtung der organischen L…sungsmittel Ethanol und Methanol lie† eine Beeinflussung des photosynthetischen Elektronentransports erkennen (siehe Abschnitt 3.3.1).
Wenn auch diese nicht so stark waren wie bei Acetonitril, sind auch die maximal l…slichen TNT-Konzentrationen im Vergleich zu Acetonitril wesentlich geringer. So wird die maximale Konzentration von TNT in Ethanol mit 12,3 g/l (Taha et al., 1997) angegeben, f•r Methanol mit 95 g/l (Jenkins, 1990). Aus der gleichzeitigen Betrachtung der Beeinflussung des CT-Biosensors durch Ethanol (52,81 % +/-5,48 % SD) und Methanol (37,79 % +/-3,36 % SD) sowie der maximalen l…slichen TNT-Konzentrationen in diesen L…sungsmitteln, fanden auch Ethanol und Methanol keine Verwendung f•r biosensorische Messungen nitroaromatischer Verbindungen. Gerade bei geringen TNT-Konzentrationen, die im Bereich der Pr•f- und Vorsorgewerte (5 bzw. 1 mg TNT/kg Boden) der UBA liegen (2004), waren Probleme aus dem Zusammenspiel von geringer Schadstoffwirkung der Testsubstanz sowie der
„Grundschadwirkung“ durch das L…sungsmittel zu erwarten.
Die in Kapitel 3.3.1 beschriebene CaCl2-L…sung konnte f•r den Nachweis von nitroaromatischen Verbindungen mittels des CT-Biosensors ebenfalls keine Verwendung finden. Zwar finden CaCl2-L…sungen als ungepufferte Salzl…sungen in der Bestimmung leichtl…slicher Schadstoffe Anwendung (Schachtschabel et al., 1989), hier musste jedoch eine Verwendung, aufgrund des sich bildenden farblosen Niederschlages bei den biosensorischen Messungen, ausgeschlossen werden. Zwar konnte mit dem ToxY-PAM noch eine Fluoreszenz in den Chloroplasten-Thylakoiden nachgewiesen werden, die Bildung des Niederschlages f•hrte aber, wie die Abbildung 3.9 verdeutlichte, zu einer nicht quantifizierbaren Einschr€nkung der Lichtbestrahlung zur Fluoreszenzanregung wie auch der Fluoreszenzdetektion. So ist z. B. die Sedimentation des Niederschlages auf dem Grund der Messk•vette, und damit direkt vor dem Fluoreszenzdetektor, nicht zu standardisieren.
Die Verwendung von Wasser als L…sungsmittel zeigte demgegen•ber mehrere Vorteile.
Durch die Verwendung von Wasser kommt es zu keiner Beeinflussung der biologischen Einheit, den Chloroplasten-Thylakoiden. Des Weiteren werden gerade durch die Verwendung
von Wasser die freien sowie die im Boden gel…sten und damit bioverf•gbaren Schadstoffe der Messung zugef•hrt (Schachtschabel et al., 1989). So gilt es in der …kotoxikologischen Betrachtung von kontaminierten B…den, die Gesamtkonzentration eines Schadstoffes von dem toxikologisch relevanten Teil zu unterscheiden (Schachtschabel et al., 1989), was die Grundlage f•r Risikoabsch€tzungen bildet (Lanno et al., 2004). W€ssrige Extrakte bilden hierbei eine verl€ssliche Grundlage f•r Mobilit€tsabsch€tzungen von Schadstoffen (Hirner et al., 1998), da die gel…sten Stoffe eine ‚bersicht •ber die Bioverf•gbarkeit bieten (Chung und Alexander, 1998).
In diesem Zusammenhang simuliert zwar die Verwendung von CaCl2-L…sungen die Bedingungen eines gepfl•gten Ackers in der Pflanzenverf•gbarkeit von Schadstoffen (Schachtschabel et al., 1989), der Einsatz von CaCl2 wird aber als manipulativ f•r die Bodenl…sungen beschrieben, wodurch w€ssrige Extrakte einer solchen CaCl2-L…sung vorzuziehen sind (K…rdel, 2001). Auch galt es, der Anforderung zu gen•gen, dass das L…sungsmittel f•r die durchzuf•hrenden biologischen Untersuchungen anwendbar war (Strong et al., 1999). Wie in Kapitel 3.3.1 dargestellt, war CaCl2, durch die Bildung des farblosen Niederschlages, in Bezug auf die Anwendbarkeit in den biologischen Messungen ebenfalls nicht brauchbar.
Auch hat Wasser gegen•ber den organischen L…sungsmitteln den Vorteil, dass es der Anforderung von Bioassays an L…sungsmitteln gen•gt, da diese in Bioassays nicht toxisch sein sollen (K…rdel und Hund, 1998). Eine Anforderung die, wie schon am Beispiel von Methanol beschrieben, f•r organische L…sungsmittel nicht zutrifft (Podola und Melkonian, 2003; Podola et al., 2004).
Somit fanden in dieser Arbeit weder organische L…sungsmittel noch CaCl2-L…sungen in der Extraktion von TNT Verwendung. Im Hinblick auf die toxischen Eigenschaften organischer L…sungsmittel sowie die Wiedergabe der Bioverf•gbarkeit von TNT durch Verwendung von Wasser wurde in Kauf genommen, dass im Durchschnitt nur 40 % des enthaltenen TNTs als in Wasser l…slich galt (Strong et al., 1999), dieser Anteil daf•r aber die l…sliche und bioverf•gbare TNT-Fraktion in der Probe widerspiegelt (Schachtschabel et al., 1989). Somit kann mit w€ssrigen Extrakten zwar nicht die Gesamtmenge der Kontamination betrachtet werden, jedoch der …kotoxikologisch bedeutende Teil, den es von ersterer zu unterscheiden gilt (Schachtschabel et al., 1989). Per Definition der IUPAC gilt, dass solche Substanzen als gebunden gelten, die sich nicht l…sen lassen, ohne dass das L…sungsmittel die chemische Natur des Bodens signifikant €ndert (Northcott und Jones, 2000). Um eine …kotoxikologische
Aussage zu erreichen, sollte gleichstehend eine „nderung der Natur der B…den bei der Extraktion vermieden werden.
Entsprechend der oben aufgef•hrten Ergebnisse wurde Wasser f•r die Extraktionen von Nitroaromaten aus B…den als L…sungsmittel verwendet, um die l…slichen und
…kotoxikologisch relevanten Konzentrationen zu erhalten. Die Erh…hung der Temperatur bei der Extraktion gegen•ber der Raumtemperatur diente hierbei zur Erh…hung der allgemeinen L…slichkeit (Harms, 1994; Geller, 2001). Obwohl Ultraschallextraktionen in der Herstellung von Bodenextrakten, auch im Hinblick auf nitroaromatische Verbindungen, eine breite Verwendung finden (Breitung et al., 1996; Eisentr€ger et al., 1998; Frische und H…per, 2003), lie†en sich in den vorliegenden Versuchen gegen•ber der Extraktion durch R•hren keine besseren Wiederfindungsraten erzielen. Die wahrscheinlichste Begr•ndung hierf•r liegt in der Durchmischung der Proben mit dem L…sungsmittel Wasser. W€hrend beim R•hren darauf geachtet wurde, dass sich die gesamte Probe im L…sungsmittel bewegte, konnte eine anhaltende Durchmischung in den Ultraschallextraktionen systembedingt nicht gew€hrleistet werden. „hnliche Ergebnisse erzielten auch K…rdel und Hund (1998) in der Unterscheidung von gesch•ttelten zu nicht gesch•ttelten Extraktionen. Bei den Ans€tzen, die mit Ultraschall extrahiert wurden, war das Wasser, das im direkten Kontakt zur Bodenmatrix und somit auch zu den Kontaminationen stand, wahrscheinlich schnell an Nitroaromaten ges€ttigt. Eine Verd•nnung der Konzentration durch Austausch mit dem umgebenden Wasser war nicht ausreichend gegeben. Die Verteilung des TNTs in der L…sung erfolgte somit wahrscheinlich bei den Ultraschallextrakten nur per Diffusion. Eventuell erreicht die Ultraschallbehandlung direkt in der Kontaktzone zwischen Wasser und Bodenmatrix die S€ttigung an Kontaminationen schneller als ohne Ultraschallbehandlung, ein Austausch mit dem restlichen Wasser war aber nicht gew€hrleistet. Da die zu geringe Durchmischung in der vorliegenden Arbeit aber den limitierenden Faktor darstellte, wurde eine Anwendung von Ultraschallbehandlungen bei der Extraktion ausgeschlossen.
Damit konnte hier eine neue Methode f•r die w€ssrige Extraktion der nitroaromatischen Verbindungen, unter besonderer Ber•cksichtigung des TNTs, durch R•hren f•r eine Stunde mit einer Erw€rmung auf 60 •C zur Verbesserung der L…slichkeit der …kotoxikologischen Bestandteile der Bodenkontaminationen entwickelt werden.