Vorbereitung der Proben für die RNA-Isolierung .1 Zellkulturüberstand

Für die RNA-Isolierung wurden log10-Verdünnungsreihen 17D-Virus, NADL und Alfort 187 haltiger Zellkulturüberstände mit EMEM in 10 ml Reagenzgläsern hergestellt:

Um von 17D-Virus haltigem Zellkulturüberstand mit einem Titer von 4 x 10⁵ KID50/ml auf eine ganze log10-Stufe zu kommen, wurden einmal 3000 µl EMEM vorgelegt und 1000 µl 17D Virus haltiger Zellkulturüberstand dazugegeben und auf einem Schüttler gut gemischt.

Für die weiteren Verdünnungen wurden pro Verdünnungsstufe 5400 µl EMEM vorgelegt und jeweils 600 µl aus der vorherigen Verdünnungsstufe zugefügt und auf einem Schüttler gut gemischt.

Ausgehend von den Ausgangstitern der verwendeten Virus haltigen Zellkulturüberstände wurden so Verdünnungsreihen bis zu kalkulierten Titern von 10^-2 KID50/ml hergestellt.

Für den Vergleich von RNA-Isolierungsmethoden mit 17D-Virus haltigen Zellkulturüberständen wurden aus der Verdünnung mit einem kalkulierten Titer von einer KID50/ml noch Verdünnungen von 0,5 KID50/ml und 0,25 KID50/ml hergestellt, indem

zweimal 3000 µl EMEM vorgelegt und mit jeweils 3000 µl aus der vorherigen Verdünnungstufe gemischt worden sind.

Die Verdünnungsreihen wurden entweder direkt für die RNA-Isolierung eingesetzt oder in Portionen von 1 ml bei NADL und Alfort 187 in 1,6 ml Mikroreaktionsgefäße bzw. in Portionen von 130 µl in 0,5 ml Mikroreaktionsgefäße abgefüllt und bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.

3.3.2 Fetales Kälberserum

Für die Erprobung der Trizol-Standard-Methode wurden BVDV positive Proben fetalen Kälberserums (BVDV-Proben-Nr. 9 und 10) unmittelbar nach dem Auftauen in einem Eisbad zur RNA-Isolierung eingesetzt.

3.3.3 Vollblut

Zur Erprobung der Trizol-Standard-Methode wurden Vollblutproben, die BVDV Proben-Nr. 1 und 2) und KSPV (KSPV-Proben-NR. 1) enthielten und mit EDTA (BVDV-Proben-Nr. 1; KSPV-Proben-NR. 1) bzw. Lithiumheparinat (BVDV-(BVDV-Proben-Nr. 2) gerinnungsgehemmt waren, direkt für die RNA-Isolierung verwendet.

Für den Vergleich der RNA-Isolierungsmethoden mit Vollblut als Probenmaterial kam sowohl mit 17D-Virus künstlich kontaminiertes als auch BVDV haltiges Vollblut zum Einsatz.

Mit 17D-Virus künstlich kontaminierte Vollblutproben wurden wie folgt hergestellt:

In 5 ml Gefäßen mit Schraubverschluss wurden einmal 1875 µl und fünfmal je 2250 µl negatives Vollblut gerinnungsgehemmt mit EDTA bzw. Lithiumheparinat vorgelegt. In das erste Gefäß wurden 625 µl 17D-Virus haltiger Zellkulturüberstand mit einem Titer von 4 x 10⁵ KID50/ml gegeben. Anschließend erfolgte eine log10-Verdünnung durch Übertragung von jeweils 250 µl 17D-Virus haltigem Material in das nächste negative Röhrchen bis zu einem kalkulierten Titer von einer KID50/ml. Die Verdünnungen 10⁵, 10³, 10², 10 und

1 KID50/ml wurden zu Portionen von 130 µl auf 0,5 ml Mikroreaktionsgefäße verteilt und bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C eingefroren.

BVDV haltige Vollblutproben wurden folgendermaßen vorbereitet:

In 5 ml Gefäßen mit Schraubverschluss wurden viermal je 2250 µl negatives Vollblut gerinnungsgehemmt mit EDTA bzw. Lithiumheparinat vorgelegt. 250 µl BVDV-positiven Blutes (BVDV-Proben-Nr. 3 bzw. 4) wurden zu den ersten negativen 2250 µl gegeben.

Anschließend wurde eine log10-Verdünnung durch Weitergabe von jeweils 250 µl BVDV-haltigem Vollblut bis zu einer Verdünnung von 10^-4 hergestellt. Unverdünntes BVDV-haltiges Vollblut und die Verdünnungen 10^-1, 10^-2, 10^-3 und 10^-4 wurden zu Portionen von 130 µl auf 0,5 ml Mikroreaktionsgefäße verteilt und bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C eingefroren.

3.3.4 Vollmilch

Zur Erprobung der Trizol-Standard-Methode wurde eine BVDV positive Vollmilchprobe (BVDV-Proben-Nr. 5), nachdem sie in einem Eisbad aufgetaut worden ist, ohne weitere Behandlung für die RNA-Isolierung eingesetzt.

Für den Vergleich der RNA-Isolierungsmethoden wurden neben unverdünnten Milchproben (BVDV-Proben-Nr. 6 und 7) Verdünnungsreihen mit BVDV negativer Milch verwendet. In 10 ml Reagenzgläsern ohne bzw. mit 2,5 mg Natriumazid wurden je 9 ml BVDV-negative Milch vorgelegt. In das erste Reagenzglas wurden 1 ml unverdünnte BVDV-haltige Milch (BVDV-Proben-Nr. 6) bzw. unverdünnte mit Natriumazid konservierte BVDV-haltige Milch (BVDV-Proben-Nr. 7) gegeben und nach gutem Mischen durch Weitergabe von jeweils 1 ml BVDV-haltiger Milch in das jeweils nächste Reagenzglas mit BVDV-negativer Milch log10 -Verdünnungsreihen bis 10^-4 hergestellt. Unverdünnte BVDV haltige Proben und die Verdünnungen 10^-1, 10^-2, 10^-3 und 10^-4 wurden zu Portionen von 130 µl auf 0,5 ml Mikroreaktionsgefäße verteilt und bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C eingefroren.

3.3.5 Sperma und Seminalplasma

Durch Absamung eines Ebers aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule wurde Ebersperma frisch gewonnen. Die spermareiche Fraktion wurde in das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover überführt und bis zur Weiterverarbeitung bei 4 °C im Kühlraum gelagert. Das Seminalplasma wurde durch Zentrifugation von 40 ml der spermienreichen Fraktion bei 3500 Umdrehungen pro Minute (UpM) für 10 min gewonnen. Künstlich mit dem KSPV-Stamm Alfort 187 kontaminierte Vollsperma- und Seminalplasmaproben wurden wie folgt hergestellt:

In 5 ml Gefäßen mit Schraubdeckelverschluss wurden 9 mal je 2250 µl negatives Vollsperma bzw. Seminalplasma vorgelegt. Zu dem ersten Röhrchen wurden 250 µl Alfort 187 haltiger Zellkulturüberstand mit einem Titer von 10⁸ KID50/ml gegeben. Anschließend erfolgte eine Verdünnung in Zehnerschritten durch Übertragung von jeweils 250 µl Alfort 187 haltigem Material in das nächste negative Röhrchen bis zu einem kalkulierten Titer von 10^-1 KID50/ml.

Die Verdünnungen mit einem kalkulierten Titer von 10³, 10², 10¹, 1,und 10^-1 KID50/ml wurden zu Portionen von 130 µl auf 0,5 ml Mikroreaktionsgefäße verteilt und bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C eingefroren.

3.3.6 Autoklaviertes Abwasser

Autoklaviertes Abwasser wurde für den Vergleich von RNA-Isolierungsmethoden durch Zusatz von 17D-Virus haltigem Zellkulturüberstand künstlich mit dem Gelbfiebervirusimpfstamm 17D kontaminiert. Anschliessend wurden log10 -Verdünnungsreihen wie folgt hergestellt:

In 1,6 ml Mikroreaktionsgefäßen wurden einmal 750 µl und viermal je 900 µl autoklaviertes Abwasser vorgelegt. In das erste Mikroreaktionsgefäß wurden 250 µl 17D-Virus haltigen Zellkulturüberstandes mit einem Titer von 4 x 10⁵ KID50/ml gegeben. Anschließend erfolgte eine Verdünnung in Zehnerschritten durch Übertragung von jeweils 100 µl 17D-Virus haltigem Material in das nächste 17D-Virus negative Mikroreaktionsgefäß bis zu einem kalkulierten Titer von 10 KID50/ml. Probenmaterial mit kalkulierten Titern von 10⁵, 10³ und

10 KID50/ml wurden unmittelbar nach Herstellung der Proben für die RNA-Isolierung eingesetzt.

3.3.7 KSPV haltiges Organmaterial

KSPV haltige Lymphknoten-, Tonsillen-, Milz- und Hodengewebeproben (KSPV-Proben-Nr.

2 bis 5) wurden wie folgt zur RNA-Isolierung vorbereitet:

Gewebestückchen, die zwischen 10 und 50 mm³ groß waren, wurden von den noch nicht vollständig getauten Gewebeproben mit Hilfe von Skalpellklingen abgeschnitten. Ein Teil der Gewebestückchen wurde in Parafilmabschnitte von 1 cm x 1 cm gewickelt, in flüssigen Stickstoff getaucht und danach im Parafilm mit dem Stempel einer Kunststoffspritze auf der Arbeitsplatte zerdrückt. Vom homogenisierten Material wurde mit einer Pipettenspitze soviel wie möglich aufgenommen und direkt für die RNA-Isolierung in der Trizol-Standard-Methode verwendet.

Alternativ erfolgte die Aufarbeitung von Organproben durch Homogenisierung in PBS, MES-Puffer oder Trizol. Erfolgte die Homogenisierung mit dem Handhomogenisiergerät Polytron PT 1200 C wurden die Gewebestückchen mit ca. 1 ml Flüssigkeit in ein 1,6 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben. Danach wurde bis zum Erreichen eines bei PBS und MES-Puffer fleischfarbenen, bei Trizol bräunlichen Überstandes mit bis zu 25000 UpM homogenisiert, bei 900 x g 10 min zentrifugiert und der Überstand direkt für die RNA-Isolierung in die Trizol-Standard-Methode eingesetzt.

Erfolgte die Homogenisierung der Gewebeproben von Hand mittels Einmalpistillen wurden die Gewebestückchen in die mit den Mikropistillen ausgelieferten 1,5 ml Mikroreaktionsgefäße gegeben. Dazu kamen 500-1000 µl Flüssigkeit. Mit dem Pistill wurde die Probe homogenisiert, bis der Überstand milchig bis fleischfarben aussah. Danach wurde niedertourig etwa 10 min bei 900 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde direkt für die RNA-Präparation genutzt.

3.3.8 Lebergewebe

Lebergewebe wurde für den Vergleich von RNA-Isolierungsmethoden wie folgt beschrieben vorbereitet:

Jeweils ein BVDV positives und fünf BVDV negative Rinderlebergewebsstückchen wurden auf einer Mikrowaage zu 10 mg in 1,6 ml Mikroreaktionsgefäße eingewogen. Dazu wurden bei Einsatz der Trizol-Standard-Methode 250 µl Trizol bzw. bei Verwendung des Machery&Nagel Nucleo Spin II Kits 250 µl Puffer RA1 gegeben und mittels Mikropistill homogenisiert. Dann wurde kurz anzentrifugiert und 200 µl des Überstandes der positiven Probe bzw. 180 µl des Überstandes aus negativem Probenmaterial in ein neues 1,6 ml Mikroreaktionsgefäß überführt. Es wurden Verdünnungen bis zu 10^-4 durch die Überführung von je 20 µl BVDV-haltigem Material zu den nächsten 180 µl BVDV negativem Überstand hergestellt. Für die RNA-Isolierung kamen jeweils 100 µl des Überstandes des unverdünnten positiven Leberhomogenisats bzw. der Verdünnungen 10^-1, 10^-2, 10^-3 und 10^-4 zum Einsatz.

3.3.9 Positive Kontrollproben

Für den Vergleich der RNA-Isolierungsmethoden mit 17D-Virus haltigem Zellkulturüberstand kam als positive Kontrolle unverdünnter 17D-Virus haltiger Zellkulturüberstand mit einem Titer von 4 x 10⁵ KID50/ml zum Einsatz.

Für die Untersuchung komplexer Probenmaterialien wurden Verdünnungsreihen 17D-Virus haltiger Zellkulturüberstande für die künstlich mit 17D-Virus kontaminierten Proben mit einem Titer von verwendet. Verdünnungen NADL-Virus haltigen Zellkulturüberstandes mit einem Titer von 10⁴ KID50/ml dienten als positive Kontrollen bei der Arbeit mit Proben, die Pestiviren enthielten. Die jeweiligen Zellkulturüberstände wurden zu 130 µl in 0,5 ml Mikroreaktionsgefäße portioniert und bis zur weiterer Verwendung bei -80 °C eingefroren.

3.3.10 Negative Kontrollproben

Als negative Proben wurden mit EDTA gerinnungsgehemmtes Rindervollblut, mit Lithiumheparinat gerinnungsgehemmtes Rindervollblut, Vollmilch, Vollmilch konserviert mit Natriumazid, Ebervollsperma, Eberseminalplasma sowie DEPC-Wasser in Portionen zu 130 µl bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C eingefroren. Die negative mit Natriumazid konservierte Vollmilch wurde hergestellt, indem 10 ml negativer Vollmilch in ein 10 ml Reagenzglas gegeben wurden, in dem 2,5 mg Natriumazid vorgelegt worden waren. Für die Untersuchung der RNA-Isolierungsmethoden mit künstlich mit 17D-Virus kontaminiertem autoklaviertem Abwasser wurde das unbehandelte autoklavierte Abwasser als negative Kontrolle verwendet. Bei der Untersuchung der RNA-Isolierung aus BVDV haltigem Lebergewebe diente der Überstand des Lebergewebehomogenisates aus BVDV negativem Lebergewebe als Negativprobe.

Das Probenmaterial war als Pestivirus- bzw. 17D-Virus negativ deklariert und ist vor Einsatz als Negativprobe auf ein negatives Resultat nach RNA-Isolierung mittels Trizol-Standard-Methode und anschließender RT-PCR zum Nachweis des 17D-Virusgenoms bzw. zum Nachweis von Pestivirusgenomen getestet worden.

3.4 RT-PCRs zum Genomnachweis von Pestiviren und des 17D-Virusgenoms