Virushaltiger Zellkulturüberstand

Virushaltiger Zellkulturüberstand wurde für die Etablierung der Trizol-Standard-Methode, zur Bestimmung der Nachweisgrenzen der RT-PCRs und zum ersten Vergleich der RNA-Isolierungsmethoden eingesetzt. Virushaltiger Zellkulturüberstand wurde ausgewählt, da eine Bestimmung der Virusgehaltes durch Titration einfach möglich war und damit die einzelnen RNA-Isolierungsmethoden vergleichend quantifiziert werden konnten. Virushaltiger Zellkulturüberstand diente weiterhin als Modell für zellarme Probenmaterialien mit einem niedrigen Gehalt zellulärer Proteine und Nukleinsäuren. Als Beispiele seien fetales Kälberserum oder Impfstoffe genannt, bei denen Kontaminationen mit Viren immer wieder ein Problem darstellen (KING u. HARKNESS 1975; NUTTAL et al. 1977).

Zellkulturüberstand ist für den Einsatz in der RT-PCR in bezug auf Inhibitoren unkritisch.

Einfaches Erhitzten auf 90 °C zum Freisetzen der viralen RNA stellt bei hohen Virustitern eine ausreichende Probenvorbereitung für die RT-PCR dar (WIRZ et al. 1993). Bei niedrigen Titern erfordert Zellkulturüberstand als zellfreies Probenmaterial und dem daraus resultierenden geringen Gehalt an Fremdnukleinsäuren trotzdem RNA-Isolierungsmethoden mit hoher Ausbeute, was als geeignetes Kriterium für die Vorauswahl von RNA-Isolierungsmethoden angesehen wurde.

5.2.2 Vollblut

Vollblut ist für die Virusdiagnostik ein wichtiges Probenmaterial. Es ist vom lebenden Organismus relativ leicht mit etablierten Verfahren gewinnbar. Bei fast allen durch RNA-Viren verursachten Erkrankungen enthält das Blut zu bestimmten Zeiten das Virus, da das Blut für das Virus häufig Transportmedium bzw. Replikationsort ist.

Vollblut ist ein anspruchsvolles Material für den Einsatz in der RT-PCR, da es RT-PCR inhibierende Komponenten enthält (PANACCIO u. LEW 1991). Die Porphyrinkomponente des Hämoglobins inhibiert die PCR (HIGUCHI 1989). Auch das zur Gerinnungshemmung bei manchen Blutproben eingesetzte Heparin stört die PCR-Reaktion (BEUTLER et al. 1990;

HOLODNIY et al. 1991). Außerdem weisen einige Blutzellen, wie z. B. Granulozyten, einen hohen Gehalt an RNasen auf (YANG u. MILLER 1985). Bei in der Literatur beschriebenen RT-PCR-Nachweisen kommt daher in den seltensten Fällen Vollblut als Probenmaterial zum Einsatz, sondern es werden Serum oder isolierte weiße Blutzellen (buffy coat) als Probenmaterial eingesetzt (DIAZ DE ARCE et al. 1998; DREW et al. 1999). Trotzdem kann es in Abhängigkeit von der RNA-Isolierungsmethode zu falsch negativen Ergebnissen kommen (DREW et al. 1999). Ebenso sind diese Verfahren von Nachteil, wenn man die genaue Lokalisation des Virus nicht kennt oder nur geringe Gesamttiter im Blut zu erwarten sind. Des Weiteren ist der Arbeitsaufwand durch die zusätzlichen Trenn- und Waschschritte höher. Ziel war es daher, die RNA-Isolierungsmethoden mit Vollblutproben zu testen. Da die meisten Blutproben für andere virologische Testverfahren gerinnungsgehemmt mit EDTA bzw. Lithiumheparinat zur Diagnostik versandt werden, wurde Blut mit den genannten Gerinnungshemmern und kein reines Blut eingesetzt.

5.2.3 Vollmilch

Vollmilch ist ein Lebensmittel, das für die menschliche Ernährung von großer Bedeutung ist und oft ohne vorherige Massnahmen zur Abtötung von Pathogenen direkt konsumiert bzw.

weiterverarbeitet wird. Es besteht dadurch das Risiko der Übertragung viraler Zoonosen.

Milch kann ebenfalls für die vertikale Übertragung von viralen Erkrankungen von Bedeutung sein (HOPKINS u. DiGIACOMO 1997). Für die Veterinärmedizin ist BVDV haltige Milch zur Zeit in der Diskussion als alternatives Probenmaterial zum Auffinden persistent mit BVDV infizierter Tiere im Rahmen von Bestandssanierungen (RADWAN et al. 1995; DREW et al. 1999).

Milch kann ein für die PCR kritisches Probenmaterial darstellen. HOTZEL et al. (1993) fanden, dass der hohe Proteingehalt der Milch die PCR-Reaktion stören kann. Dagegen ist der Einsatz der in der Milch enthaltenen Zellen für die PCR unproblematisch (LIPKIN et al.

1993).

Bisher wurde beim RT-PCR-Nachweis des BVDV-Genoms aus Milch so vorgegangen, dass die RNA-Isolierung aus den durch Zentrifugation aus der Milch gewonnenen somatischen

Zellen erfolgte (RADWAN et al. 1995; DREW et al. 1999). Dafür war ein hoher Aufwand bei der Probenaufbereitung notwendig. Durch Autolyse oder Gefrier-Tau-Zyklen aus den Zellen freigesetzte und frei vorkommende Viruspartikel gehen für die RNA-Isolierung verloren, weshalb Probentransport und -aufarbeitung sehr schnell erfolgen müssen. Die Probenvolumen lagen in Bereichen, die nicht mehr im Mikroreaktionsgefäßmaßstab aufgearbeitet werden konnten. Für die eigenen Untersuchungen wurde daher die gesamte Vollmilch für die RNA-Isolierung verwendet.

In der Milchproduktion werden regelmäßig Proben zur Bestimmung der Milchqualität entnommen. Diese werden häufig über längere Zeiträume gelagert und für diesen Zweck z. B.

mit Natriumazid konserviert. Da dieses konservierte Material für retrospektive oder epidemiologische Untersuchungen von Interesse sein könnte, wurde neben nicht konservierter Milch auch entsprechend konservierte Milch in die Untersuchungen einbezogen.

5.2.4 Sperma und Seminalplasma

Sperma kann für die Übertragung viraler Erkrankungen in Human- und Veterinärmedizin von großer Bedeutung sein. In der Veterinärmedizin seien als Beispiele für RNA-Viren, das Virus der Equinen Arteritis und das PRRSV genannt (SHIN et al. 1997; STARICK 1998). Für KSPV wird ebenfalls eine Übertragung durch das Sperma beim natürlichen Deckakt bzw. bei der künstlichen Besamung diskutiert (GEIGER 1939; DE SMIT et al. 1999). Im EU-Referenzlabor für Klassische Schweinepest wurden in den Jahren 1997 und 1998 Übertragungsversuche mit dem Sperma künstlich mit KSPV infizierter Eber durchgeführt. Mit Hilfe der zellkulturellen Virusisolierung gelang nur in zwei Fällen der KSPV-Nachweis aus den zur künstlichen Besamung eingesetzten Spermafraktionen (FLOEGEL et al. 2000).

Sperma und Seminalplasma enthalten zytotoxische Bestandteile (DARCELL u. COULTER 1976; KAHRS et al. 1980). Die zellkulturelle Virusisolierung ist daher sehr aufwendig und nicht immer erfolgreich (FLOEGEL et al. 2000). Der Nachweis der viralen RNA mittels RT-PCR wäre eine Alternative. Sperma kann Inhibitoren der RT- RT-PCR enthalten (SCHEIT et al.

1979; REDDY et al. 1983; LUGARO et al. 1988; DA SILVA et al. 1995; SEMPRINI et al.

1998).

Die in der Literatur beschriebenen zum Teil sehr aufwendigen Vorarbeiten zur Entfernung möglicher Inhibitoren vor der RNA-Isolierung für den RT-PCR-Nachweis aus Sperma, wie z. B. Chromatografie mit Sephacryl S-400 für den BVDV-Nachweis aus Bullensperma (DA SILVA et al. 1995), sollten wegen möglicher Virusverluste nicht durchgeführt werden. Da der RT-PCR-Nachweis aus 100 bis 500 µl EAV und PRRSV haltigem Sperma unter Verwendung geeigneter RNA-Isolierungsmethoden in der Literatur dokumentiert ist (ST-LAURENT et al.

1994; CHRISTOPHER-HENNINGS et al. 1995; GILBERT et al. 1997; OLEKSIEWICZ et al.1998), wurde für die eigenen Versuche daher künstlich mit KSPV kontaminiertes Sperma und Seminalplasma direkt für die RNA-Isolierung eingesetzt. Ausgehend von BVDV-Titern von 5 bis 75 KID50/ml (DA SILVA et al. 1995) und einem PRRSV-Titer von 30 KID50/ml (SHIN et al. 1997) in Spermaproben wurden Sperma- und Seminalplasmaproben mit kalkulierten KSPV-Titern von 10³ KID50/ml bis 0,1 KID50/ml Probenmaterial künstlich kontaminiert.

5.2.5 Autoklaviertes Abwasser

Zur Simulation von Abwasser wurde autoklaviertes Abwasser aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingesetzt. Von dem autoklavierten Abwasser war bekannt, welche Tierkörper und Desinfektionsmittel in den Autoklavierprozeß eingebracht worden sind. Natürlich vorkommendes Abwasser dagegen hat eine dem autoklavierten Abwasser aus der Pathologie ähnlich heterogene, jedoch oftmals unbekannte und im Nachhinein nur mit großem Aufwand bestimmbare Zusammensetzung. Der Einsatz von natürlichem Abwasser erschien auch aus Arbeitsschutzgründen (wegen möglicher darin enthaltener pathogener Erreger) bedenklich, während im autoklavierten Abwasser alle Erreger durch den Autoklavierprozeß inaktiviert waren.

Abwasser stellt für die Virusdiagnostik ein wichtiges Probenmaterial dar. Es kann für die Verbreitung pathogener Erreger insbesondere durch die Kontamination von Lebens- bzw.

Futtermitteln auf Feldern oder in der Aquakultur verantwortlich sein (GREISER-WILKE u.

FRIES 1994). Verschiedene Enteroviren, Echovirus, Hepatitis A Virus, Norwalk Virus (GANTZER et al. 1997; GILGEN et al. 1997; DIVIZA et al. 1998; GANTZER et al. 1998;

GANTZER et al. 1999; GRIFFIN et al. 1999), aber auch Hepatitis E Virus (JOTHIKUMAR et al. 1993) und HIV (ANSARI et al. 1992; MOORE 1993) wurden bereits mittels RT-PCR in Abwässern nachgewiesen.

Im Abwasser sind eine Reihe Substanzen natürlichen Ursprungs wie Gewebematerial, Fette, Blut- und Faecesbestandteile sowie Urin von Menschen und Tieren, Salze, aus dem Boden stammende Tannine und Huminstoffe, aber auch Stoffe industrieller Herkunft, wie Öle, Fette, Detergentien u.s.w. enthalten. Einige dieser Substanzen könnten PCR- bzw. RT-PCR-Nachweise hemmen und müssten entfernt werden (MUIR et al. 1993; SHIEH et al. 1995;

SCHWAB et al. 1996). Auch besteht bei der RNA-Freisetzung aus Abwasserproben das Risiko des RNA-Abbaus durch die in der Probe enthaltenen RNasen (RICHARDSON et al.

1988).

Mit dem Gelbfiebervirusimpfstamm 17D künstlich kontaminiertes autoklaviertes Abwasser wurde daher unverzüglich nach der Kontamination zur RNA-Isolierung eingesetzt.

5.2.6 Lebergewebe

Für die Erprobung der RNA-Isolierung aus Organmaterial wurde exemplarisch die Leber ausgewählt. Lebergewebe ist von großen und kleinen Tieren sowie dem Menschen verhältnismäßig einfach als Biopsie oder Autopsiematerial gewinnbar. Außerdem ist die Leber Zielorgan vieler viraler Erkrankungen (HOWARD et al. 1984; SLAUGHTER 1985;

TANDON u. ACHARYA 1987). Nach MÜLHARDT (1999) enthält die Leber im Vergleich zu anderen Organen, wie z. B. der Niere, allgemein mehr RNA. Durch die Stoffwechselaktivität sind auch die Virustiter relativ hoch und bei transienten Infektionen kann in der Leber länger Virus nachgewiesen werden als in Lymphknoten oder Milz, wo die Viren einer verschärften Inaktivierung unterliegen (ROSEN et al. 1999). Das in der Leber enthaltene Heparin, sowie Abbauprodukte des Hämoglobins und über die Jahre akkumulierte Schadstoffe, könnten in Konzentrationen vorliegen, die die RT-PCR inhibieren. Durch die hohe Stoffwechselaktivität ist ebenfalls ein hoher Gehalt an RNasen zu erwarten.