Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide sind in Tabelle 8.3 zusammengefasst.
Tabelle 8.3: verwendete Plasmide
Plasmid
Resis-tenz
Charakteristika Referenz/Herkunft
Expressions- und Klonierungsvektoren
pBlueskript II SK+ Ampr Klonierungsvektor Agilent Technologies, Santa Clara, USA
pcDNA™3.1 Ampr, Neor
Expressionsvektor life technologies™
(Carlsbad, CA, USA)
138
pcDNA5/TO Ampr Expressionsvektor life technologies™
(Carlsbad, CA, USA) pBlue_VEGF-Luci Ampr firefly-Luciferase in pBluescript KS+, flankiert
von 5´und 3´UTR des humanen VEGF-A
Dr. Sebastian de Vries, (De Vries 2014)
pcDNA3_eIF2α Ampr, Neor
Expressionsvektor; eIF2α, human (Wildtyp) in pcDNA3
diese Arbeit pcDNA3_eIF2α
S51D
Ampr, Neor
Expressionsvektor; eIF2α, human, pseudophos-phoryliert (S51D) in pcDNA3
diese Arbeit
pcDNA3-ff-Luci-IκB-α-UTRs
Ampr, Neor
firefly-Luciferase in pcDNA3, flankiert von 5´und 3´UTR des humanen IκB-α
diese Arbeit
pcDNA3-HCV-IRES-SL1-2
Ampr, Neor
stemloops I bis II der HCV-IRES in pcDNA3 (Nukletid 1-132)
diese Arbeit
pcDNA3-HCV-IRES-SL1-3
Ampr, Neor
stemloops I bis III der HCV-IRES in pcDNA3 (Nukletid 1-331)
diese Arbeit
pcDNA3-HCV-IRES-SL1-4
Ampr, Neor
stemloops I bis IV der HCV-IRES in pcDNA3 (Nukletid 1-397)
diese Arbeit pcDNA3_PKR Ampr,
Neor
Expressionsvektor, PKR, human (Wildtyp) in pcDNA3 mit N-terminalem FLAG-tag
Dipl. Biol. Eileen Winkler * pcDNA3_PKR-KD Ampr,
Neor
Expressionsvektor; PKR, human, Deletion der dsRBD (Aminosäureposition 2-170) in pcDNA3
diese Arbeit pcDNA5/TO-IFNβ Ampr Expressionsvektor; IFNβ, human Dr. René Geißler*
pFLAG-TIA-1vI Ampr, Neor
Expressionsvektor; TIA-1-Isoform 1 (kurz) in pcDNA3 mit N-terminalem FLAG-tag
Dipl. Biol. Eileen Winkler * pFLAG-TIA-1vII Ampr,
Neor
Expressionsvektor; TIA-1-Isoform 2 (lang) in pcDNA3 mit N-terminalem FLAG-tag
Dipl. Biol. Eileen Winkler * pIRES2-eGFP Kanr
Neor
Expressionsvektor Clontech laboratories,
Moun-tain View, USA pIRES2-eGFP-T7 Kanr
Neor
pIRES2-eGFP-Expressionsvektor mit T7-Promotor-Sequenz upstream der EMCV-IRES
diese Arbeit
pVEGF-3´UTR Ampr humane VEGF-A-3´UTR in pBluescript Dr. Sebastian de Vries (Martin-Luther-Universität, Halle, D) pVEGF-5´UTR Ampr humane VEGF-A-5´UTR in pBluescript Susan Weinlich
(Martin-Luther-Universität, Halle, D) Für virale Replikon-RNAs codierende Plasmide
HCV-JFH-pUC18 Ampr Derivat des pSGR-JFH1-Replikon (Kato et al.
2003)mit HDV-Ribozym (HDVr) downstream der 3´UTR
Dr. René Geißler* (pSGR-JFH1: Prof. Dr. Takaji Wakita, NIID, Tokyo; mta), (Geißler 2012)
HCV-GND-pUC18 Ampr Derivat des pSGR-JFH1-Replikon (Kato et al.
2003) mit HDV-Ribozym (HDVr) downstream der 3´UTR und Aminosäureaustausch in NS5BD318N, replikationsdefizient
Dr. René Geißler*, (Geißler 2012)
pDI9c codiert für DI9c-Replikon (BVDV, Stamm: cp7) Dr. Claus W. Grassmann, (Behrens et al. 1998) pDI9c-mut codiert für DI9c-Replikon (BVDV, Stamm: cp7)
mit Aminosäureaustausch NS5BD448T und NS5BD449R, replikationsdefizient
Dr. Claus W. Grassmann, (Behrens et al. 1998) pDI9c-HDVr Ampr Derivat des pDI9c, codiert für DI9c-Replikon, mit
HDV-Ribozym (HDVr) downstream der 3´UTR
diese Arbeit pDI9c-mut-HDVr Ampr Derivat des pDI9c, codiert für DI9c-Replikon, mit
HDV-Ribozym (HDVr) downstream der 3´UTR und Aminosäureaustausch NS5BD448T und NS5BD449R, replikationsdefizient
diese Arbeit
pSinRep5 Ampr Expressionsvektor, codiert für Sindbis-Replikon life technologies™
(Carlsbad, CA, USA) pWNV-HDVr Ampr Derivat des pWNV-Replikon Stamm
NY2000-crow3356 (Shi et al. 2002) mit HDV-Ribozym (HDVr) downstream der 3´UTR
Dr. Susann Friedrich*, (Friedrich 2014) pWNV-mut-HDVr Ampr Derivat des pWNV-Replikon Stamm
NY2000-crow3356 (Shi et al. 2002) mit HDV-Ribozym (HDVr) downstream der 3´UTR und Aminosäu-reaustausch in NS5D669A, replikationsdefizient
Dr. Susann Friedrich*, (Friedrich 2014)
*Mitarbeiter/in der Arbeitsgruppe Mikrobielle Biotechnologie, MLU Halle-Wittenberg
139 Plasmidkonstruktion
pcDNA3-Expressionskonstrukte: Der pcDNA3-Expressionsvektor ermöglicht die konstitutive Gen-expression in humanen Zellen. Er vermittelt eine Resistenz gegenüber Ampicillin, wodurch die Ver-mehrung und Selektion in E. coli-Zellen erleichtert wird.
pcDNA3_eIF2α: Die für das humane eIF2α codierende Sequenz wurde durch RT-PCR von Gesamt-RNA aus Huh7-Zellen mit den Primern eIF2α-f und eIF2α-r amplifiziert und über die BamHI- und XhoI-Restriktionsschnittstellen in den pcDNA3-Vektor ligiert.
pcDNA3_PKR: Die für die humane PKR codierende Sequenz wurde durch RT-PCR von Gesamt-RNA aus Huh7-Zellen mit den Primern PKR_WT-f und PKR_WT-r amplifiziert und über die HindIII- und BamHI-Restriktionsschnittstellen in den pcDNA3-Vektor ligiert. In einer weiteren PCR wurde unter Verwendung der Primer FLAG-f und FLAG-r die für den FLAG-tag codierende Sequenz ebenfalls amplifiziert und über die BamHI und XhoI-Schnittstellen an das 3´Ende der für die PKR codierenden Sequenz ligiert, wodurch bei Expression dieser Sequenz ein PKR-FLAG-Fusionsprotein (FLAG C-terminal) synthetisiert wird. Dieses Plasmid wurde von Fr. Dipl. Biol. Eileen Winkler zur Verfügung gestellt.
pcDNA3_PKR_KD: Die für die Aminosäuren 171-551 der humanen PKR codierende Sequenz wurde von pcDNA3_PKR durch PCR mit den Primern PKR_KD-f und PKR_KD-r amplifiziert und über die BamHI- und XhoI-Restriktionsschnittstellen in den pcDNA3-Vektor ligiert. Mittels der verwendeten Primer wurden zusätzlich ein Translationsstartcodon (forward-Primer, upstream der für die PKR codie-renden Region), sowie zwei Translationsstopcodons (reverse-Primer, downstream der für die PKR codierenden Region) eingeführt.
pcDNA3_eIF2αS51D: Dieses Plasmid codiert für eine phosphomimetische Variante des humanen eIF2α. Die Generierung des Plasmids erfolgte mittels ortsgerichteter Mutagenese unter Verwendung der Primer eIF2α_S51D-f und eIF2α_S51D-r und der DNA des pcDNA3_eIF2α-Plasmids als Templa-te. Dabei wurde durch die ortsgerichtete Mutagenese ein Serin an Aminosäureposition 51 des huma-nen eIF2α gegen ein Aspartat substituiert.
pcDNA3_HCV-IRES_SL1-2/ pcDNA3_HCV-IRES_SL1-3/ pcDNA3_HCV-IRES_SL1-4: Mittels PCR wurden für bestimmte Fragmente der HCV-IRES codierende Sequenzbereiche von HCV-JFH-pUC18 amplifiziert. Die generierten Konstrukte codieren alle für am 3´Ende verkürzte subgenomische virale RNA-Moleküle, welche das authentische 5´Ende der viralen RNA codieren. Für die Amplifikation wur-de als forward-Primer jeweils HCV_IRES-f verwenwur-det, welcher zusätzlich für die BamHI-Erkennungssequenz codiert. Als reverse-Primer dienten HCV_IRES_SL1-2-r IRES_SL1-2: codiert für stem loops I und II der HCV-IRES), HCV_IRES_SL1-3-r (pcDNA3_HCV-IRES_SL1-3: codiert für stem loops I, II und III der HCV-IRES) und HCV_IRES_SL1-4-r (pcD-NA3_HCV-IRES_SL1-4: codiert für stem loops I, II, III und IV der HCV-IRES). Die reverse-Primer co-dieren zusätzlich für die XhoI-Erkennungssequenz. Die generierten PCR-Produkte wurden über die BamHI- und XhoI- Restriktionsschnittstellen in den pcDNA3-Vektor ligiert.
140 Sonstige Plasmide:
pBlue_VEGF-Luc: Dieses Konstrukt wurde zur Verfügung gestellt von Dr. Sebastian de Vries. Es basiert auf dem Klonierungsvektor pBluscript KS+ und beinhaltet die für die firefly-Luciferase codie-rende Sequenz, welche von der humanen VEGF-A-5´UTR und -3´UTR flankiert wird.
pcDNA3-ff-Luci-IκB-α-UTRs: Mittels PCR wurden durch RT-PCR von Gesamt-RNA aus Huh7-Zellen mit den Primern IκB-α-5´UTR-f und IκB-α-5´UTR-r die 5´UTR und mit den Primern IκB-α-3´UTR-f und IκB-α-3´UTR-r die 3´UTR des humanen IκB-α amplifiziert. Des Weiteren wurde von pBlue_VEGF-Luci durch PCR mit den Primern IκB-α-Luci-f und IκB-α-Luci-r die für die firefly-Luciferase codierende Se-quenz amplifiziert. Durch Restriktionshydrolyse der resultierenden PCR-Produkte mittels BpiI wurden komplementäre Überhänge generiert, die die Fusion der Fragmente in der Orientierung 5´UTR IκBα -firefly-Luciferase - 3´UTR IκB-α ermöglichten. Mittels der von den Primern 5´UTR-f und IκB-α-3´UTR-r codierten Restriktionsschnittstellen für HindIII und XhoI wurde diese Sequenz schließlich in den pcDNA3-Vektor ligiert.
pDI9c-HDVr und pDI9c-mut-HDVr: Diese Konstrukte wurden mittels Subklonierung generiert und stellen Derivate der von Dr. C. W. Grassmann (Behrens et al. 1998) zur Verfügung gestellten Plasmi-de pDI9c und pDI9c-mut dar. Dazu wurPlasmi-den zunächst die PlasmiPlasmi-de pDI9c und pDI9c-mut mittels Plasmi-der Restriktionsendonukleasen ClaI und SmaI geschnitten und die resultierenden 1224 bp umfassenden Fragmente in den Klonierungsvektor pBlueskript II SK+ (ebenfalls mit ClaI und SmaI geschnitten) li-giert. Die erhaltenen Subklone (pBlue_DI9c, pBlue_DI9c-mut) wurden mittels SmaI linearisiert. Unter Verwendung der Primer HDVr-f und HDVr-r wurde die für ein Ribozym des Hepatitis-Delta-Virus ko-dierende Sequenz (Länge: 67 bp) mittels PCR amplifiziert und in die linearisierten Plasmide pBlue_DI9c, pBlue_DI9c-mut ligiert. Die resultierenden Plasmide wurden wiederum mit den Restrikti-onsendonukleasen ClaI und SmaI geschnitten und die resultierenden, 1291 bp umfassenden Frag-mente isoliert. Diese wurden mit den bei Restriktionshydrolyse der Plasmide pDI9c und pDI9c-mut mit ClaI und SmaI generierten größeren Fragmenten (ca. 8,8 kb; umfasst Vektor, sowie die für die Repli-kons DI9c- bzw. DI9c-mut codierende Sequenz, abzüglich der jeweiligen Sequenzbereiche, welche von den ClaI- und SmaI-Erkennungssequenzen flankiert werden) ligiert.
pIRES2-eGFP-T7: Der Expressionsvektor pIRES2-eGFP wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und EcoRI geschnitten und das resultierende größere Vektorfragment isoliert. Unter Verwen-dung der Primer T7-f und T7-r wurde die für den T7-Promotor codierende Sequenz generiert und mit dem präparierten pIRES2-eGFP-Vektorfragment ligiert. Die T7-Promotor-Sequenz ermöglicht die in vitro Transkription der eGFP-RNA.