Die simultane Transfektion des WNV- und des HCV-mut-Replikons induziert die

Wie bereits in Kapitel 3.3.2 angedeutet, kann spekuliert werden, dass die transiente Replika-tion des HCV-Replikons in Huh7-Zellen zelluläre Komponenten und/oder Signalkaskaden aktiviert, welche entweder durch die WNV-Replikation nicht aktiviert oder sogar inhibiert wer-den. In beiden Fällen wäre es denkbar, dass durch die simultane intrazelluläre Präsenz der replikationsdefizienten HCV-mut-RNA und der replizierenden WNV-RNA die notwendigen

48 Voraussetzungen gegeben sind, um diese Signalkaskade zu aktivieren und somit die VEGF-A-mRNA-Stabilisierung zu induzieren.

Deshalb wurden Huh7-Zellen transient mit der in vitro transkribierten RNA der beiden Repli-kons WNV und HCV-mut simultan transfiziert und die Degradation der VEGF-A-mRNA mit-tels Actinomycin D-Endpunkt-Assay 48 h p.t. analysiert. Neben dieser Co-Transfektion wur-den Transfektionen der einzelnen Replikons als Negativkontrolle mitgeführt. Wie in Abbil-dung 3.8 A dargestellt, entsprach die residuale VEGF-A-mRNA-Menge 180 min nach Acti-nomycin D-Zugabe in mit beiden RNAs simultan transfizierten Huh7-Zellen (mit ca. 67% der Ausgangs-Transkriptmenge) in etwa der Menge, welche bei transienter Replikation des HCV-Replikons detektiert wurde (vgl. Kapitel 3.2). Die Transfektion der einzelnen Replikon-RNAs (WNV, HCV-mut) hatte wie erwartet keinen Einfluss auf die Degradation der VEGF-A-mRNA. Zudem wurde die Halbwertszeit der VEGF-A-mRNA in Huh7-Zellen 48 h nach simul-taner Transfektion des WNV- und des HCV-mut-Replikons mittels Actinomycin D-Assay be-stimmt. Unter Annahme einer vollständigen Degradation der VEGF-A-mRNA entsprach sie jener nach Transfektion der Huh7-Zellen mit dem HCV-Replikon (vgl. Anhang 8.4).

Unter der Annahme, dass die HCV-RNA den Auslöser des Prozesses darstellt, welcher zu der verringerten Degradation der VEGF-A-mRNA führt, erscheint es zunächst kontrovers, dass die transiente Transfektion von Huh7-Zellen mit der HCV-mut-RNA nicht zur Stabilisie-rung der VEGF-A-mRNA führt. Es muss jedoch beachtet werden, dass die virale RNA inner-halb der Wirtszelle Degradationsprozessen unterliegt, welche bei einer nicht replizierenden viralen RNA zum vollständigen Abbau führt. Es wäre somit denkbar, dass die beobachteten Unterschiede nach transienter Transfektion von Huh7-Zellen mit dem HCV-Replikon und der HCV-mut-RNA darauf zurückzuführen sind, dass aufgrund der Replikation der HCV-RNA höhere virale RNA-Mengen innerhalb der Zelle vorliegen. Eine positive Korrelation zwischen der Quantität der viralen RNA innerhalb der Wirtszellen und der Stabilität der VEGF-A-mRNA erschien zunächst plausibel, da die maximale Stabilität der VEGF-A-mRNA 48 h nach tran-sienter Transfektion der Huh7-Zellen mit dem HCV-Replikon detektierbar ist, was dem Zeit-punkt der maximalen viralen Replikation entspricht.

Deshalb war es von entscheidender Bedeutung zu überprüfen, ob bei simultaner Transfekti-on der ReplikTransfekti-ons WNV und HCV-mut ein Einfluss auf die Quantität der HCV-mut-RNA im Vergleich zur alleinigen Transfektion mit HCV-mut-RNA festgestellt werden kann. Die simul-tane intrazelluläre Präsenz von WNV- und HCV-mut-RNA könnte zum einen aufgrund von Konkurrenz um die zelluläre Degradationsmaschinerie den Abbau der HCV-mut-RNA inhibie-ren, zum anderen musste ausgeschlossen werden, dass die durch die Translation des WNV-Replikons synthetisierten Proteine die HCV-mut-RNA in trans replizieren. Deshalb wurden Huh7-Zellen zum einen simultan mit den Replikons WNV und HCV-mut und zum anderen

49 nur mit dem HCV-mut-Replikon transient transfiziert. Im Zeitraum bis 48 h p.t. wurden zu verschiedenen Zeitpunkten jeweils Proben entnommen und die HCV-mut-RNA-Quantitäten mittels qRT-PCR ermittelt. Die HCV-mut-RNA-Mengen, welche in den Zellen jeweils unmit-telbar nach der Transfektion gemessen wurden (Zeitpunkt 0 h), wurden als 100% definiert und die RNA-Mengen der übrigen Zeitwerte auf diesen Anfangswert bezogen. Es ist anzu-merken, dass zum Zeitpunkt 0 h in beiden Proben (HCV-mut transient, WNV + HCV-mut transient) ähnliche Quantitäten der HCV-mut-RNA detektiert wurden. Wie Abbildung 3.8 B entnommen werden kann, konnte durch simultane Transfektion mit dem WNV-Replikon kein Einfluss auf die Quantität der HCV-mut-RNA festgestellt werden. Die Degradation der nicht replizierenden HCV-mut-RNA verlief bei beiden Transfektionen analog. Die bei Co-Transfektion der Replikons WNV und HCV-mut beobachtete erhöhte Stabilität der VEGF-A-mRNA ist somit nicht auf unterschiedliche Quantitäten der HCV-mut-RNA in den Wirtszellen zurückzuführen.

Die PAMPs der HCV-RNA, welche zur Aktivierung der PRRs führen, sind bereits in früheren Studien identifiziert worden [RIG I: Triphosphat-Struktur am 5´Terminus, poly-U/UC-Motive in 3´UTR der viralen RNA (Hornung et al. 2006, Pichlmair et al. 2006, Schmidt et al. 2009, Schnell et al. 2012, Yoneyama et al. 2004); PKR: virale IRES (Arnaud et al. 2011, Shimoike et al. 2009, Toroney et al. 2010)]. Da die HCV-mut-RNA diese Elemente enthält, wurde ver-mutet, dass ihre intrazelluläre Präsenz die Aktivierung der PRRs induzieren kann, welche als essentielle Komponenten der HCV-induzierten VEGF-A-mRNA-Stabilisierung identifiziert wurden. Da die alleinige transiente Transfektion der HCV-mut-RNA jedoch keinen Einfluss auf die VEGF-A-mRNA-Degradation ausübt, wurde weiterhin spekuliert, dass neben der Präsenz viraler RNA, welche die entsprechenden PAMPs enthält, auch die virale Replikation für die Induktion der VEGF-A-mRNA-Stabilisierung essentiell ist.

Da bereits gezeigt werden konnte, dass die transiente Transfektion der Huh7-Zellen mit dem HCV-Replikon in der Aktivierung der PKR resultiert, die mit dem WNV-Replikon hingegen nicht (vgl. Kapitel 3.3.2) und weiterhin bekannt war, dass die PKR für die HCV-induzierte Stabilisierung der VEGF-A-mRNA essentiell ist (vgl. Kapitel 3.3.1), sollte im Folgenden un-tersucht werden, ob die simultane Transfektion von Huh7-Zellen mit den Replikons WNV und HCV-mut in der Aktivierung der PKR resultiert. Zu diesem Zweck wurde in analoger Vorge-hensweise zu dem in Kapitel 3.3.2 erläuterten Experiment 12 h und 48 h nach der Co-Transfektion von Huh7-Zellen mit dem WNV- und dem HCV-mut-Replikon die Aktivierung der PKR mittels Western Blot überprüft. Als Kontrollen dienten naive Huh7-Zellen, sowie tran-sient mit dem HCV-mut-, bzw. dem WNV-Replikon transfizierte Zellen. Wie in Abbildung 3.8 C dargestellt, konnte die Phosphorylierung der Proteine PKR und eIF2α 12 h nach simul-taner Transfektion der Replikons WNV und HCV-mut ebenso nachgewiesen werden, wie

50 nach transienter Transfektion des HCV-mut-Replikons. In den Proben der naiven bzw. tran-sient mit dem WNV-Replikon transfizierten Zellen konnten hingegen keine Signale für die phosphorylierten Varianten von PKR und eIF2α detektiert werden. Diese Beobachtungen stehen in Übereinstimmung mit den in Kapitel 3.3.2 dargestellten Ergebnissen. Zum Zeit-punkt 48 h p.t. konnte in keiner der Proben eine Phosphorylierung dieser Proteine nachge-wiesen werden. Es kann vermutet werden, dass dies auf die Degradation der HCV-mut-RNA zurückzuführen ist. Dass die simultane Transfektion von Huh7-Zellen mit dem WNV- und dem HCV-mut-Replikon zum Zeitpunkt 48 h p.t. dennoch in einer erhöhten Stabilität der VEGF-A-mRNA resultiert, deutet darauf hin, dass die Aktivierung der PKR zum Zeitpunkt 48 h p.t. nicht essentiell für die Stabilisierung der VEGF-A-mRNA ist.

A B

Abbildung 3.8: Die simultane Transfektion von Huh7-Zellen mit dem WNV- und dem HCV-mut-Replikon in-duziert die Stabilisierung der VEGF-A-mRNA. (A) Analyse der VEGF-A-mRNA-Degradation in Huh7-Zellen 48 h nach transienter Transfektion mit dem WNV-Replikon, dem HCV-mut-Replikon bzw. simultaner Transfektion beider Replikons durch Actinomycin D-Endpunkt-Assay. Die jeweilige gemessene VEGF-A-mRNA-Menge der transient transfizierten Zellen zu Beginn des Actinomycin D-Endpunkt-Assays wurde als 100% definiert (0 min).

Die Mittelwerte wurden mittels eines Studentschen T-Tests auf signifikante Abweichung hin geprüft. (**) P<0,001 (B) Bestimmung der relativen HCV-mut-RNA-Menge nach transienter Transfektion von Huh7-Zellen mit dem HCV-mut-Replikon bzw. simultaner Transfektion der Replikons WNV und HCV-mut mittels qRT-PCR. (C) Reprä-sentativer Western Blot der Proteine GAPDH, PKR-P und eIF2α-P 12 h p.t. (Abbildung links), sowie 48 h p.t.

(Abbildung rechts) in Gesamtzell-Proben von naiven Zellen, sowie nach transienter Transfektion von Huh7-Zellen mit dem WNV-, bzw. dem HCV-mut-Replikon und simultaner Transfektion mit beiden Replikons. GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet. Der Nachweis der WNV-Replikation erfolgte durch Detektion der viralen Po-lymerase WNV-NS5. Das Experiment wurde zweimal unabhängig voneinander durchgeführt.

0 20 40 60 80 100 120

0 180

relative VEGF-A-mRNA-Menge [%]

Zeit nach Zugabe von Actinomycin D [min]

HCV-mut + WNV WNV HCV-mut

0 20 40 60 80 100 120

0 12 24 36 48

relative JFH1mut-RNA-Menge [%]

Zeit nach transienter Transfektion [h]

HCV-mut HCV-mut + WNV

**

C

51 Es kann angenommen werden, dass die simultane Transfektion mit replizierender WNV-Replikon-RNA und nicht replizierender HCV-mut-RNA einen vergleichbaren Prozess akti-viert, wie die transiente Replikation des HCV-Replikons. In beiden Fällen sind sowohl eine replizierende virale RNA als auch die PAMPs der HCV-RNA in den Wirtszellen präsent. Es erscheint plausibel, dass bei simultaner Transfektion mit replizierender WNV-Replikon-RNA und nicht replizierender HCV-mut-RNA die Rolle der HCV-mut-RNA in der Aktivierung der PKR und der darauffolgenden Phosphorylierung von eIF2α besteht.

3.3.4 Die Stabilisierung der VEGF-A-mRNA kann in Huh7-Zellen, in denen