1.3.1 Kernspinresonanz (NMR)
Die kernmagnetische Resonanz oder Nuclear Magnetic Resonance (NMR) ist eine spektroskopische Methode, die auf der Wechselwirkung zwischen Atomkernen und elektromagnetischer Strahlung in einem äußeren homogenen Magnetfeld beruht.
Atome mit einer ungeraden Ordnungszahl besitzen ein magnetisches Moment.
Dieses richtet sich in einem starken Magnetfeld parallel (energieärmere Orientierung) oder antiparallel (energiereichere Orientierung) zum angelegten Feld aus. Die Energiedifferenz zwischen diesen beiden Zuständen, die im Bereich langwelliger elektromagnetischer Strahlung (Radiowellen) liegt, hängt von der Stärke des angelegten äußeren Magnetfeldes und der Größe des kernmagnetischen Momentes ab. Entspricht die Energiezufuhr einer eingestrahlten Radiowelle der Energie-differenz, wird diese Frequenz absorbiert. Die magnetischen Momente der Kerne werden dabei von dem energetisch günstigen Zustand in den energetisch ungünstigen überführt. Dieser Vorgang heißt magnetische Resonanz. Im umgekehrten Prozess – der Relaxation – wird magnetische in thermische Energie umgewandelt. Da das angelegte Magnetfeld am Atomkern durch induzierte Sekundärfelder der Elektronen verstärkt oder geschwächt werden kann, sind diese auftretenden Energiedifferenzen keine Konstante. Dies ist der Grund warum sich Kerne mit unterschiedlicher elektronischer Umgebung in ihrer Resonanzfrequenz unterscheiden [111].
Die 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie bilden die Grundlage für viele Strukturermittlungen in der organischen Chemie. Neben den eindimensionalen Spektren sind die zweidimensionalen Experimente mittlerweile genauso wichtig.
Dazu gehören die homonuklearen Protonenexperimente 1H,1H-COSY (1H,1 H-Correlated Spectroscopy), ROESY (Rotating frame NOESY) und NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy), die heteronuklearen Experimente HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) und HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation), sowie das kombinierte Experiment HMQC-COSY.
Um die 13C-Signale von CH3-, CH2-, CH-Gruppen und quartären Kohlenstoffatomen unterscheiden zu können, wurde das J-modulierte Spinecho-Experiment angewendet. Es liefert für Signale von quartären Kohlenstoffen und CH2-Gruppen ein anderes Vorzeichen als für Signale von CH- und CH3-Gruppen.
Das 1H,1H-COSY-Experiment korreliert die 1H-Verschiebungen der koppelnden Protonen eines Moleküls. Im Spektrum unterscheidet man zwei Typen von Signalen.
Zum einen diejenigen, die auf der Diagonale liegen, denen das eindimensionale NMR-Spektrum entspricht. Zum anderen die Crosspeaks auf der Fläche, auch Kreuz- oder Korrelationssignale genannt, die Kopplungen zwischen einzelnen Protonen anzeigen. Zieht man ausgehend von diesen Crosspeaks senkrechte und waagrechte Linien zur Diagonalen, befinden sich dort die Signale der koppelnden Protonen. Aus dem 1H, 1H-COSY erhält man Information über vicinale, geminale und sogenannte W-Kopplungen der Protonen eines Moleküls [112-113].
Im ROESY- und NOESY-Experiment kann die räumliche Nähe von Protonen erkannt werden. Man macht sich die Übertragung der Magnetisierung von einem zu benachbarten Protonenkern zunutze (dipolare Wechselwirkung), den sog. Kern-Overhauser-Effekt. Mit dieser Methode ist es beispielsweise möglich, die relative Position von Substituenten zu bestimmen [114].
Die heteronuklearen HMQC- und HMBC-Experimente werden invers gemessen, das heißt, es werden nicht die unempfindlichen 13C-Kerne, sondern die 6.000-mal empfindlicheren Protonen zur Signaldetektion verwendet. Im HMQC-Experiment korreliert in der F1-Achse die 13C-Verschiebung mit den 1H-Verschiebungen in der F2 -Achse über direkte 1JCH-Kopplungen. Man erhält über die Crosspeaks die genaue Zuordnung der Protonen zu den jeweiligen Kohlenstoffatomen [115].
Das HMBC-Experiment gibt Auskunft über CH-Beziehungen über mehrere Bindungen. Optimiert wurde diese Methode auf 3JCH-Kopplungen, aber im Spektrum erkennt man neben den CH-Korrelationen über 3 Bindungen auch welche über 2 oder 4 Bindungen. Auf diese Weise ist es möglich, auch quartäre Kohlenstoffatome zuzuordnen [115].
1.3.2 Massenspektrometrie
Die zu untersuchende Substanz wird bei der Massenspektrometrie im Hochvakuum verdampft und durch Beschuss mit beschleunigten Elektronen ionisiert. Es entstehen geladene Ionen, die durch ein elektrisches Feld beschleunigt werden. Anschließend werden die geladenen Molekül-Ionen in einem homogenen Magnetfeld proportional zu ihrer Masse aufgetrennt [116].
Bei der Elektronenstoß-Massenspektrometrie (EI-MS) besitzen die beschleunigten Elektronen, die zur Ionenerzeugung verwendet werden, meist eine Energie von 70 eV. Auf Grund dieser hohen Energie werden neben dem Molekül-Radikal-Kation auch geladene Fragment-Ionen gebildet [111]. Erhält man kein Molekül-Ion-Signal, da die Fragmentierungsreaktionen überwiegen, die Verbindungen zu groß oder schwer verdampfbar sind, verwendet man eine andere Ionisierungsmethode, wie FAB-MS (Fast Atom Bombardement) bzw. auch LSI-MS (Liguid Secondary Ion Mass Spectrometry) genannt. Die gelöste Probe wird auf eine Glycerin-Matrix aufgebracht und mit Primärionen (Cs+) beschossen. Es bilden sich Sekundärionen ([M-H]−) aus den zu untersuchenden Molekülen, die im Massenanalysator detektiert werden.
Durch diese weiche Ionisierung erhält man das um eine Masseneinheit erniedrigte Molekülion und wenige Fragementionen, die durch Abspaltung leicht eliminierbarer Gruppen entstehen [117-118].
Die Elektrospray-Ionisation (ESI) ist ein weiteres Verfahren, um die molare Masse zu bestimmen. Die Substanzlösung wird in eine Kammer gesprüht und strömt als Sprühnebelstrahl durch eine zylindrische Elektrode, so dass geladene Tröpfchen entstehen, die unter Verdampfung des Lösungsmittels kleiner werden. Mit dieser Methode können große Moleküle sowie Verbindungen, die bei EI-MS zu stark fragmentieren, untersucht werden. Ein Elektrospray-Massenspektrometer kann mit einer HPLC gekoppelt werden [118].
Mithilfe der hochauflösenden ESI-MS (HR-ESI-MS) kann durch Zugabe von Brucin als internen Standard die hochaufgelöste Masse von dem zu untersuchenden Molekül bestimmt werden.
Das Massenspektrometer (MS) kann mit einem Gaschromatografen (GC) gekoppelt werden. Dabei trennt der GC die zu untersuchenden Substanzgemische auf und das MS dient als Detektor. Der Vorteil von GC-MS ist, dass nur geringe Substanzmengen im Nanogrammbereich benötigt werden, um ein Spektrum zu erhalten. Allerdings müssen die Substanzen verdampfbar sein [118-119]. Mithilfe des GC-MS lassen sich beispielsweise Steroidgemische untersuchen, wobei die Strukturbestimmung durch computerunterstützte Vergleiche mit Spektren einer Bibliothek erfolgt.
1.3.3 Bestimmung der Reihenzugehörigkeit der Zucker
In der Natur kommen manche Zucker wie die Arabinose sowohl in der D- als auch in der L-Form vor. Deswegen ist es notwendig, die Reihenzugehörigkeit der Monosaccharide zu bestimmen. Dies ist weder mithilfe von NMR-Experimenten noch durch GC-Trennungen an Normalphasen möglich, da die Enantiomerenpaare nach Trimethylsilylierung mit MSTFA identische Retentionszeiten zeigen. Reznicek et al.
[120] und Gerwig et al. [121] entwickelten eine Methode, die die Trennung der Diastereomeren mittels GC an einer Normalphase erlaubt. Die zu einem Enantiomerenpaar gehörenden Monosaccharide, z. B. β-D-Glycopyranose und β -L-Glycopyranose werden mit (R)-(−)-2-Butanol umgesetzt. Dadurch wird das Enantiomerenpaar in ein Diastereomerenpaar überführt, das sich nach Trimethylsilylierung mittels GC trennen lässt.
Für die Bestimmung der Reihenzugehörigkeit der Zuckereinheiten der Triterpensaponine werden davon 500 µg hydrolysiert und das getrocknete Hydrolysat mit (R)-(−)-2-Butanol umgesetzt. Die Zuordnung der Monosaccharideinheiten zur D- oder L-Reihe erfolgt durch den Vergleich der Retentionsindizes des trimethylsilylierten Produkts mit denen der Referenzverbindung.
OH HClg
(R)-2-Butyl-β-D-glycopyranosid (R)-( )-2-Butanol
-D-Glycopyranose
β
O OH HO
HO OH OH O
OH HO
HO
OH O
Abb. 32: Bestimmung der Reihenzugehörigkeit von Monosacchariden am Beispiel der β-D-Glycopyranose