Vergleichende genomische Hybridisierung (mCGH)

Durch die Markierung mit modifizierten Nukleotiden (0) kann das einzelsträngige WGA-Produkt durch eine kompetitive Hybridisierung mit dem Referenz-WGA-WGA-Produkt verglichen werden.

3.11.1 Präparation von Metaphasenchromosomen

Es werden 20 ml heparinisiertes Blut eines gesunden männlichen Spenders mit Lymphozyten-Kulturmedium (250 ml RPMI Medium, 37,5 ml FCS, 5 ml 100x Penicillin/

Streptomycin, 2,5 ml L-Glutamin (200 mM), 3 ml Phytohämagglutinin) vermischt, in 10 ml Kulturfläschchen verteilt und 72 h bei 37 °C in einem CO2-Brutschrank (5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit) inkubiert. Die Kulturfläschchen werden alle 24 h geschüttelt. Durch Phytohämagglutinin wird die Teilung der Leukozyten stimuliert. Zur Arretierung der Chromosomen in der Metaphase werden anschließend 100 µl Colcemidlösung (10 µg/ml) zugegeben und weitere 45 min im Brutschrank inkubiert. Dieser Mitose-Hemmstoff verhindert die Ausbildung der Spindelfasern. Darauf werden die Lymphozytenkulturen in 15 ml Zentrifugenröhrchen transferiert, die Zellen durch Zentrifugation (453 x g, 10 min) pelletiert, in 10 ml hypotoner Lösung resuspendiert (75 mM KCl, 37 °C) und 8 min bei 37 °C inkubiert.

Die gequollenen Zellen werden erneut abzentrifugiert und in 10 ml -20 °C kaltem Fixativ (Methanol und Eisessig im Verhältnis 3:1) vorsichtig resuspendiert. Eisessig führt zur Lyse der Erythrozyten, Methanol denaturiert die Proteine (u.a. Histone) und dehydriert die Probe.

Die Reste der lysierten Erythrozyten werden durch zweimaliges Zentrifugieren und Waschen in 10 ml Fixativ entfernt, danach kann die Zellsuspension in 2 ml Fixativ bei –20 °C bis zum Auftropfen auf Objektträger gelagert werden.

Zur Herstellung von Metaphasen-Objektträgern werden Glasobjektträger in einer Küvette mit 100 % EtOH über Nacht entfettet und gereinigt. Vor dem Auftropfen der Metaphasen-Lymphozyten, die mit 10 ml Fixativ gewaschen wurden, wird der Alkohol abgegossen und die Objektträger in destilliertem Wasser 5 min bei -20 °C gekühlt. Das Auftropfen der in Methanol-Eisessig fixierten Lymphozytenkultur erfolgt mit einer Pasteurpipette aus einem Abstand von ca. einem halben Meter. Dadurch platzt der Kern und die Metaphasen-Chromosomen werden freigesetzt (Abbildung 6). Das verbleibende Fixativ wird durch Inkubation des Objektträgers auf einer Heizplatte 3 h verdampft. Dabei wird die Umgebungs-luft künstlich durch gleichzeitiges Auflegen von feuchten Tüchern mit Wasserdampf angereichert, was die Qualität der Metaphasenpräparation verbessern soll. Die Objektträger werden bis zur weiteren Verwendung in 100 % EtOH bei 4 °C gelagert.

Abbildung 6: Objektträger mit Metaphasen-Präparation: A: Die weißen Pfeile zeigen einzelne Metaphasen, die schwarzen Pfeile zeigen Zellkerne, die sich in der Interphase befinden. B: Vergrößerter Ausschnitt aus A;

Abbildung von zwei Metaphasen, die nebeneinander liegen. Verwendung mit freundlicher Genehmigung von M.

Gužvić

3.11.2 Hybridisierung der markierten WGA-Produkte

Das, wie in Abschnitt 0 beschrieben, markierte Test-WGA-Produkt und das Referenz-WGA-Produkt werden über Nacht bei -20 °C gefällt (Tabelle 25). Die Fällung wird für 45 min bei 20.817 x g und 4° C abzentrifugiert, das Pellet mit 700 µl EtOH 70 % gewaschen, weitere 10 min zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Das Pelett wird luftgetrocknet und in 7 µl 100 % Formamid bei 37° C 45 min unter Schütteln (600 rpm) gelöst. Formamid soll die Temperatur der Probe bei der Hybridisierung mit den Chromosomen reduzieren. Darauf werden 7 µl einer Lösung aus 30 %-igem Dextransulfat in 4x SSC zugegeben und weitere 30 min bei 37 °C geschüttelt. Dextransulfat bindet H2O und führt dadurch zu einer höheren lokalen DNA-Konzentration, was zu einer Verkürzung der Hybridisierungsdauer führt.

Anschließend wird die DNA bei 78 °C für 6 min denaturiert und die C0t-1 DNA 30 min bei 37 °C mit den repetitiven Anteilen der DNA prähybridisiert. Dies soll deren störenden Einfluss auf die mCGH verhindern.

Parallel dazu wird ein Metaphasen-Objektträger von Zytoplasma-Resten und RNA befreit und die darauf befindliche chromosomale DNA denaturiert. Zuerst werden die Objektträger in

Tabelle 25: Ansatz der Fällung von Test- und Referenz-DNA

1x (µl)

PCR-Amplifikat der Test-DNA (2x) 80

PCR-Amplifikat der Referenz-DNA 40

human C0t-1 DNA (1 µg/µl) Roche 90

human C0t-1 DNA (1 µg/µl) Molecular Probes 30

Heringsperm-DNA (10 µg/µl) 15

Natriumacetat (3 M, pH 5,2) 27

EtOH 100 % (eisgekühlt) 600

Σ 882

2x SSC (pH 7,4) gewaschen und mit 50 µl Pepsin (100 µg/µl) in 100 ml HCl (10 mM, pH 2,0) bei 37 °C für 4 min inkubiert. Bei diesem Schritt werden die Proteine verdaut. Der Verdau wird durch dreimaliges Waschen in PBS gestoppt, der Objektträger in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 85 % und 100 % Ethanol) bei 4 °C dehydriert und getrocknet. In einem Wasserbad werden 100 ml 70 % Formamid in 2x SSC (pH 7,2) auf 70 °C erhitzt und der Objektträger darin für 1 min 50 sec denaturiert. Der Objektträger wird erneut in einer aufsteigenden Alkoholreihe getrocknet, der DNA-Hybridisierungsansatz aufgetragen und das Hybridisierungsfeld durch ein Deckglas (18 x 18 mm) abgedeckt und mit Gummikleber (Fixogum) verschlossen. Die Hybridisierung findet 48 h bei 37 °C in feuchter Atmosphäre statt. Nach der Hybridisierung wird vorsichtig das Deckgläschen über dem Hybridisierungs-feld abgenommen und der Objektträger viermal jeweils 5 min in 4x SSC + 0,2 % Tween (42 °C) in einer Hellendahl-Küvette auf dem Orbitalschüttler gewaschen. Anschließend wird dreimal jeweils 5 min mit 1x SSC (60 °C) auf dem Schüttler gewaschen. Nach einem Umpufferungs-Schritt in PBS + 0,2 % Tween (42 °C) werden die unspezifischen Bindungs-stellen für 30 min mit 1 ml Block-Lösung (PBS pH 7,4 + 0,2 % Tween, 3 % BSA, 5 % FCS) bei 37 °C abgesättigt. Die überschüssige Block-Lösung wird mit PBS + 0,2 % Tween (42 °C) entfernt und der Objektträger mit 200 µl Antikörpermix (Tabelle 26) unter einem Deckglas 60 min bei 37 °C unter Lichtschutz inkubiert. Überschüssiger Antikörper wird in drei 5 min Waschschritten bei 42 °C in 4x SSC + 0,2 % Tween unter Lichtschutz entfernt. Anschließend wird die DNA 3 min mit 1 ml DAPI-Lösung (1 µg/ml in 4x SSC + 0,2 % Tween) angefärbt, um die Chromosomenbänderung sichtbar zu machen. Der Objektträger wird kurz mit destilliertem Wasser gewaschen, im Dunkeln getrocknet und mit Vectashield H-1000 einge-deckelt. Dies verhindert das Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe. Öl-Immersion) mit 100-facher Vergrößerung von ca. 20 geeigneten Metaphasen jeweils ein Bild mit den Fluoreszenzfiltern für DAPI, FITC und Cy3.5 aufgenommen (Tabelle 13, Abbildung 7). Die Chromosomen der digitalisierten Metaphasen können mit geeigneter Software (CytoVision/Genus, Applied Imaging) in ein Karyogramm sortiert werden.

Abbildung 7: Auswertung der mCGH am Fluoreszenzmikroskop: Von geeigneten Metaphasen wird jeweils ein Bild mit den Fluoreszenzfiltern für DAPI, FITC und Cy3.5 aufgenommen. A: Metaphase, DAPI; B: einzelne Chromosomen einer Metaphase mit Bänderung, unsortiert; C: einzelne Chromosomen mit Bänderung, sortiert;

D: Metaphase, Überlagerung FITC und Cy3.5; E: einzelne Chromosomen sortiert, Cy3.5; F: einzelne Chromosomen sortiert, FITC; G: einzelne Chromosomen sortiert, Überlagerung FITC und Cy3.5; H: einzelne Chromosomen sortiert, Bänderung mit artifiziell gefärbter Überlagerung

Nach softwareunterstützter Normalisierung wird das Fluoreszenzverhältnis (Test-DNA/Referenz-DNA: FITC/Cy3.5) aller analysierten Chromosomen in einem mCGH-Profil dargestellt. Ein Gewinn (Amplifikation) bzw. Verlust (Deletion) von genomischer DNA gegenüber der Test-DNA wird angezeigt, wenn das Fluoreszenzverhältnis den Wert 1,25 überschreitet bzw. 0,75 unterschreitet. Heterochromatinbereiche wie die p-Arme der Chromosomen 13, 14, 15, sowie Chromosom Y werden nicht ausgewertet. Um kumulative mCGH-Profile zu erhalten, werden die erhaltenen genomischen Aberrationen der einzelnen mCGH-Analysen nach den Richtlinien der ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature, 1995, Abbildung 47) entsprechend der Anforderung für das webbasierte mCGH-Analyseprogramm Progenetix (Baudis und Cleary, 2001) in Tabellenform gebracht. Nach dem Hochladen der Tabelle wird das Format „ISCN annotation table“ und die Technik „chromosomal CGH“ ausgewählt, um die genomischen Aberrationen in einem kumulativen mCGH-Profil zu visualisieren. Dabei werden alle weiteren voreingestellten Parameter übernommen.

Hierarchisches Clustering der mCGH-Daten

Das hierarchische (bottom-up) complete linkage Clustering wird unter Verwendung der euklidischen Distanz durchgeführt. Die Auswertung erfolgte durch Inka Appel unter Verwendung der Software R-Bioconductor.