EpCAM-Einzelfluoreszenzfärbung und intrazelluläre Spezifität

Zunächst wurde die Einfachfärbung mit dem EpCAM-Antikörper E144 etabliert.

Anschließend wurde die Spezifität von E144 (Bindung an die intrazelluläre Domäne, EpIC) mit dem EpCAM-Antikörper Ber-EP4, der an die extrazelluläre Domäne (EpEX) bindet, verglichen. Ziel war es zu bestätigen, dass E144 spezifisch die intrazelluläre Domäne erkennt. Als Positivkontrolle wurden die Zelllinien MCF-7 und HL60_EpCAM verwendet. Als Negativkontrolle diente HL60_wt. Die Kernfärbung wurde mit DAPI oder Hoechst 33342 durchgeführt. Mit Hilfe von DAPI konnten bei der Suspensionsfärbung tote Zellen identifiziert werden, da der Antikörper in Suspension nur den Kern toter Zellen färbt.

EpCAM-Einzelfluoreszenz-Färbung

Als Primärantikörper wurde der Kaninchen-Antikörper E144 verwendet, der spezifisch an die C-terminale Domäne von EpCAM bindet. Dieser wurde in unterschiedlichen Verdünnungen getestet (Inkubation 30 min) und mit zwei verschiedenen Sekundärantikörpern kombiniert (Tabelle 29). Die Färbung erfolgte analog Kapitel 3.2.1, wobei die Blockierung 20 min

Tabelle 29: Übersicht der getesteten Verdünnungen und Antikörper: EpCAM-Fluoreszenzfärbung;

Konzentration des Antikörpers E144 nicht bekannt Primärantikörper Sekundärantikörper

E144 Kaninchen (1:50) α-Kaninchen-Cy3 F(ab)2 (15 µg/ml)

E144 Kaninchen (1:100) α-Kaninchen-Alexa 555 (20 µg/ml) E144 Kaninchen (1:250)

E144 Kaninchen (1:500)

stattfand. Alle Isotypkontrollen waren negativ. Die Auswertung unter dem Fluoreszenz-mikroskop zeigte, dass die Primärantikörper-Verdünnung von 1:500 nicht alle MCF-7-Zellen färbte, bei 1:250 war teilweise nur eine schwache Färbung sichtbar. Jedoch waren zwischen 1:100 und 1:50 keine Unterschiede hinsichtlich der Fluoreszenzintensität erkennbar. Daher wurde für alle weiteren Färbungen die Verdünnung 1:100 gewählt. PBL wurden nicht gefärbt.

Die Verwendung des Sekundärantikörpers α-Kaninchen-Alexa 555 lieferte eine stärkere Fluoreszenz als die Färbung mit α-Kaninchen-Cy3. Zusätzlich wurde ein Direktvergleich beider sekundärer Antikörper mit Haftobjektträgern, auf denen Patientenknochenmark mit MCF-7 1:100 gemischt wurden, durchgeführt. Hier zeigte sich ein deutlicher Vorteil von Alexa 555. Bei der Färbung von Patienten-Knochenmark war die Färbung mit Cy3 nur sehr schwach erkennbar, wohingegen sich Alexa 555 deutlich vom Hintergrund abhob (Daten nicht gezeigt). Für alle weiteren Färbungen mit dem EpCAM-Antikörper E144 (α-EpIC) wurde daher der Sekundärantikörper α-Kaninchen-Alexa 555 verwendet.

Intrazelluläre Spezifität des EpCAM Antikörpers E144

Zuerst wurde überprüft, ob α-EpIC unspezifisch die extrazelluläre EpCAM Domäne färbt.

Dazu wurde eine Suspensionsfärbung mit den Zelllinien MCF-7 und HL60_EpCAM (1:20 verdünnt mit PBL) analog der Suspensionsfärbung gegen EpCAM durchgeführt (Kapitel 3.2.2, Tabelle 30). Beide Zellsuspensionen wurden gleichzeitig mit beiden Primärantikörpern gefärbt. Anschließend wurde jeweils ein Teil mit 1 ml DAPI- (0,2 ng/ml) oder Hoechst 33342-Lösung (1,25 ng/ml) inkubiert, um Zellen mit nicht intakter Zellmembran zu identifizieren. Die Auswertung im Cy3-Kanal zeigte bei beiden Zelllinien keine gefärbten lebenden Zellen, da E144 bei intakten Zellen nicht ins Innere der Zelle gelangen kann. Im FITC-Kanal war eine Färbung der extrazellulären Domäne durch Ber-EP4 sichtbar. Durch die DAPI-Färbung erkenntliche tote Zellen waren vereinzelt positiv im Cy3 Kanal. Durch die zerstörte Zellmembran gelangte der Antikörper in die Zelle (Abbildung 10A-D). PBL wurden nicht gefärbt. Dies lässt folgern, dass keine unspezifische Färbung der extrazellulären Domäne durch E144 stattgefunden hat.

Des Weiteren wurde untersucht, ob sich die Lokalisation der intrazellulären EpCAM-Domäne von der extrazellulären Domäne hinsichtlich der Färbung durch α-EpIC und α-EpEX unter-

Tabelle 30: Übersicht der verwendeten Antikörper zum Vergleich von EpIC und EpEX Primärantikörper Sekundärantikörper Isotypkontrolle EpIC: E144: α-EpCAM-Kaninchen α-Kaninchen-Alexa 555 Kaninchen IgG

Konzentration nicht bekannt, 1:100 20 µg/ml Konzentration nicht bekannt, 1:100 EpEX: Ber-EP4: α-EpCAM-FITC α-FITC-Alexa 488 Maus IgG1

5 mg/ml 10 µg/ml 1 µg/ml

Abbildung 10: Suspensionsfärbung mit EpIC und EpEX (MCF-7): In Suspension konnte nur die extrazelluläre EpCAM-Domäne gefärbt werden. Die tote (geplatzte) Zelle unten ist stark DAPI gefärbt und zusätzlich EpIC positiv, da der Antikörper aufgrund der defekten Zellwand ins Zellinnere gelangen konnte; A: Überlagerung Cy3, FITC, DAPI; B: Überlagerung Cy3, DAPI; C: Überlagerung: FITC, DAPI; D: Hellfeld; α-EpIC (E144, orange), α-EpEX (Ber-EP4, grün), DAPI (blau); Skala 50 µm; Belichtung 5 sec

scheidet. Dazu wurde die oben genannte Färbung mit permeabilisierten, fixierten Zellen durchgeführt. Hierfür wurde zuerst der EpIC-Antikörper in Anwesenheit von Saponin zugegeben und nach dem Waschen mit dem EpEX-Antikörper gefärbt. Diese Reihenfolge ist essentiell, da die Permeabilisierung reversibel ist und sich die Zellen in Abwesenheit von Saponin wieder verschließen. Sowohl die EpEX- als auch die EpIC-Färbung lieferte stark gefärbte doppelpositive MCF-7 und HL60_EpCAM Zellen. Bei vielen Zellen war deutlich ein Größenunterschied zwischen der extrazellulären EpEX- und der intrazellulären EpIC-Färbung sichtbar, die durch die unterschiedliche Lokalisation beider EpCAM-Domänen zu erklären ist (Abbildung 11A-D). Es ist eine linienartige grüne Membranfärbung (α-EpEX) zu erkennen. Im Vergleich dazu lieferte α-EpIC eine rote, eher ungeordnete Färbung im Inneren der Zelle. Mit der Software Axio Vision LE wurde diese Zelle vermessen und dreimal der Durchmesser der Zelle bestimmt (Abbildung 11E-H). Das arithmetische Mittel betrug für EpIC 18,3 µm (σ=0,37 µm) und für EpEX 18,8 µm (σ=0,30 µm), was signifikant unterschiedlich war (p=0,022, Student’s t-Test). Unter gleichen Bedingungen wurde eine EpIC/EpEX-Doppelfärbung auf Haftobjektträgern durchgeführt. Das Ergebnis war eine deutliche Färbung der intrazellulären und extrazellulären Domäne durch beide Antikörper (Abbildung 12A-D).

Bei 100-facher Vergrößerung einer gefärbten MCF-7 Zelle war erkennbar, dass um den Zellkern mehr rote Punkte (EpIC-Färbung) vorhanden waren, im Vergleich zur eher gelben Membranfärbung (gleichmäßige Überlagerung von EpEX (grün) und EpIC (rot), Abbildung

A B

C D

13C). Alle beschriebenen Färbungen wurden zur Kontrolle mit HL60_wt Zellen durchgeführt und erwiesen sich als negativ. Die Isotypkontrollen waren ebenfalls negativ.

Abbildung 11: Färbung mit EpIC und EpEX an fixierten Zellen (HL60+): Färbung der intrazellulären und extrazellulären EpCAM-Domäne. Die EPIC und EpEX positive Zelle zeigt einen Größenunterschied zwischen dem EpEX- und EpIC-Färbebereich; A: Überlagerung Cy3, FITC, DAPI; B: Überlagerung FITC, DAPI;

C: Überlagerung: Cy3, DAPI; D: Hellfeld; E+G: Cy3, Vergrößerung und Messrahmen 3,81 x 3,90 (relative Einheit); F+H: FITC, Vergrößerung und Messrahmen 3,95 x 4,01 (relative Einheit); α-EpIC (E144, orange), α-EpEX (Ber-EP4, grün), DAPI (blau); Skala 50 µm; Belichtung 3 sec

A B

C D

E F

G H

Abbildung 12: Färbung mit EpIC und EpEX auf Haftobjektträger (MCF-7): Färbung der intrazellulären und extrazellulären EpCAM-Domäne. A: Überlagerung Cy3, FITC, DAPI; B: Überlagerung: FITC, DAPI;

C: Überlagerung: Cy3, DAPI; D: Hellfeld; α-EpIC (E144, orange), α-EpEX (Ber-EP4, grün), Hoechst (blau); Skala 50 µm; Belichtung 3,2 sec

Abbildung 13: EpIC- und EpEX-Färbung – Detailaufnahme: Färbung der intrazellulären und extrazellulären EpCAM-Domäne (Haftobjektträger, MCF-7). A: Überlagerung Cy3, FITC, DAPI; B: Überlagerung: FITC, DAPI;

C: Überlagerung Cy3, FITC; Zwischen der gelben Membranfärbung (gleichmäßige Überlagerung von grün (EpEX) und rot (EpIC)) und der eher rötlichen Färbung im Inneren der Zelle sind deutliche Unterschiede erkennbar. D: Überlagerung Cy3, DAPI; α-EpIC (E144, rot), α-EpEX (Ber-EP4, grün), Hoechst (blau); 100-fache Vergrößerung

A B

C D

A B

C D

Damit konnte nicht nur gezeigt werden, dass α-EpIC spezifisch die intrazelluläre Domäne färbt und α-EpEX die extrazelluläre Domäne, sondern es konnte auch die unterschiedliche Lokalisation der EpCAM-Domänen durch die Färbebereiche verdeutlicht werden. Aufgrund dieser Ergebnisse, der monoklonalen Herkunft aus dem Kaninchen und der besseren Farbkombinationsmöglichkeiten wurde der EpIC-Antikörper E144 für die Doppelfärbung verwendet.