Vergleich der Probenstruktur oligo- und multilamellarer SC Lipid-

KAPITEL VI ERGEBNISSE UND DISKUSSION PRÄPARATION OLIGOLAYER

36 Da in den vorangehenden Abschnitten bereits festgestellt wurde, dass eine PEI-Schicht die Lipide an der Waferoberfläche fixiert, könnte die Anwendung dieser Schicht das beobach-tete Zusammenfließen der Lipide während des Annealing verhindern. Um diesen Aspekt zu untersuchen, wurde eine oligolamellare SC-Lipidprobe der Mischung CER[AP]:CHOL:SA im Molverhältnis 1:0,3:1 mit einer PEI-Schicht präpariert und einem Annealingzyklus un-terzogen. Die Probe vor Annealing zeigt gut definierte Kiessig-Oszillationen (Abb. 18a, grau), aus denen eine Probendicke von 215,3 Å berechnet werden kann (Tabelle 4). Die Schichtdicke eines Bilayers wird dabei bestimmt zu 45,42 Å, was mit bereits beschriebenen Wiederholabständen vergleichbarer Mischungen übereinstimmt6, 48, 97, 98. In dieser Phase, hier als Phase A beschrieben, sind alle drei Komponenten der Lipidmischung vorhanden.

Abb. 18a) XR-Kurven einer 3,5 mg/ml Lipidmischung aus CER[AP]:CHOL:SA (1:0,3:1;

CHCl3: MeOH (13:1)), rotationsbeschichtet bei 4000 rpm unmittelbar nach PEI-Beschichtung vor (grau) und nach (schwarz) der Durchführung einer Annealingprozedur. b) XR-Kurven von Multilayern vor (grau) und nach (schwarz) der Durchführung einer Annealingprozedur. Die Buchstaben indizieren die Zugehörigkeit der Peaks zu den unterschiedlichen Phasen A-D.

Durch den Abstand der Peaks können die in Tabelle 4 angegebenen Dicken ermittelt werden.

Die Probenpräparation erfolgte durch aufsprühen von 10 mg der Lipidmischung aus CER[AP]:CHOL:SA (1:0,7:1; CHCl3:MeOH (15:1)), bei 50 °C nach PEI-Beschichtung. Für eine bessere Übersicht sind die Kurven in Y-Richtung verschoben.

Tabelle 4: Bilayer- (d) und Gesamtschichtdicken (t), ermittelt aus den in Abb. 18a und b dargestellten XR-Kurven vor und nach Annealing. Für die untersuchten Proben konnten verschiedene Wiederholabstände er-mittelt werden, für die jeweils eine mögliche Zusammensetzung angegeben ist.

Phase

Oligolayer Multilayer

mögliche Zusammensetzung vor

Annealing

nach Annealing

vor Annealing

nach Annealing

d [Å]

A 45,42 ± 0,66 -- 44,82 ± 0,11 46,57 ± 0,06 CER[AP] + CHOL + SA

B -- -- -- 42,26 ± 0,03 SA

C -- 40,52 ± 0,52 40,04 ± 0,13 39,90 ± 0,01 CER[AP] + CHOL + SA

D -- -- 34,28 ± 0,09 34,13 ± 0,02 CHOL

t [Å] 215,3 ± 6,3 182,8 ± 2,3 -- -- --

b) a)

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37 Nach der Anwendung des Annealingprozesses sind ebenfalls Kiessig-Oszillationen und Bragg Peaks zu erkennen (Abb. 18a, schwarz), was auf eine, nach wie vor, intakte Bilayerstruktur hinweist. Aufgrund der stärkeren Bindungskräfte in Anwesenheit des PEI sind die SC-Lipide größtenteils auf der Waferoberfläche fixiert. Sie können sich folglich nicht mehr in einem derartigen Ausmaß umordnen, wie es für die Probe ohne PEI-Schicht beschrieben ist. Allerdings sind nach dem Annealing die Maxima und Minima weniger stark ausgeprägt, sodass die XR-Kurve breitere Peaks mit geringerer Intensität zeigt. Als Resultat der kleineren Bilayerschichtdicke von 40,52 Å, hier als Phase C bezeichnet, verringert sich die berechnete Probendicke auf 182,8 Å. Es ist bereits beschrieben, dass das reine L-Enantiomer von CER[AP] nach einem Aufheiz- und Abkühlzyklus eine V-förmige Konformation mit einem Wiederholabstand von 37 Å einnehmen kann¹⁰⁴. In Verbindung mit dem nicht abgewinkelten D-CER[AP] mit einem Wiederholabstand von 47 Å und den zusätzlich eingelagerten Komponenten CHOL und SA könnte bei einem hohen Anteil an V-förmigen Konformeren eine Struktur mit etwa 40 Å Dicke ausgebildet worden sein. Ein weiterer Einflussfaktor auf die verringerte Schichtdicke könnte eine Neigung der gesamten Lipidschicht senkrecht zur Membranebene sein, hervorgerufen durch die beim Annealing zusätzlich zur Verfügung gestellte Energie. Hierbei erhöht sich auch die Mobilität der Lipide, wodurch sich die Ordnung innerhalb der Membran, wenn auch nur geringfügig, verschlechtert. Demzufolge kann der erwartete Effekt bezüglich der Verbesserung der Lipidordnung durch die Anwendung eines Annealingzyklus für die hier präparierten oligolamellaren Modelle nicht beobachtet werden.

Im Gegensatz zu oligolamellaren Lipidmodellen, ist bei multilamellaren Proben die Gesamt-schichtdicke so groß, dass der Abstand benachbarter Kiessig-Oszillationen Δ𝑄_{𝐾𝑖𝑒𝑠𝑠𝑖𝑔} zu klein wird, um noch ausreichend aufgelöst werden zu können. Dafür kann bei der Unter-suchung des multilamellaren Lipidmodells einer Mischung aus CER[AP], CHOL und SA (1:0,7:1) das Auftreten zahlreicher Bragg Peaks beobachtet werden (Abb. 18b). Vor dem Annealing (grau) sind die Intensitäten der Bragg Peaks, besonders bei hohen Q-Werten, sehr gering. Dies deutet auf eine eher ungeordnete, pulverähnliche Probe hin. Die auftretenden Bragg Peaks beschreiben eine Probe mit drei Phasen unterschiedlicher Schichtdicke (Tabelle 4). Die Phase mit dem Wiederholabstand von 34,28 Å, hier als Phase D bezeichnet, kann phasensepariertem kristallinem CHOL-Monohydrat zugeordnet werden^{98, 105}. Die zwei Phasen mit den Schichtdicken von 44,82 Å und 40,04 Å stellen die bereits erläuterten Phasen A und C dar, die alle Lipide der Mischung enthalten, sich aber vermutlich in den Konfor-mationen des CER[AP]-Moleküls unterscheiden. Dabei würde für Phase A unter trockenen Bedingungen eine voll gestreckte Konformation des CER energetisch bevorzugt sein³², wäh-rend in Phase C große Mengen des V-förmigen Konformers enthalten sein würden.

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38 Durch die Anwendung einer Annealingprozedur werden die wenig geordneten Lipide in eine hochgeordnete lamellare Struktur gezwungen, die durch viele scharfe Bragg Peaks mit hoher Intensität gekennzeichnet ist (Abb. 18b, schwarz). Dabei ordnen sich die Lipide in vier Pha-sen unterschiedlicher Schichtdicke an (Tabelle 4). Die PhaPha-sen C und D zeigen keine Verän-derungen des Wiederholabstandes als Folge des Annealing, während der Wiederholabstand der Phase A auf 46,57 Å ansteigt. In diesem Zusammenhang ist in der Literatur beschrieben, dass es bei den unter trockenen Bedingungen voll gestreckten CER-Molekülen mit Erhöhung der Umgebungsfeuchte zur Ausbildung einer Haarnadelkonformation durch Umklappen ei-ner der Kohlenstoffketten kommt³². Durch die beim Annealing eingebrachte Luftfeuchtig-keit könnte demzufolge eine Membran mit einem höheren Anteil an CER in Haarnadelkon-formation ausgebildet werden, der zu einer Erhöhung der Schichtdicke führt. Dieser Sach-verhalt könnte auch für die Schichtdickenveränderungen in der Phase A verantwortlich sein.

Im Gegensatz zu den beobachteten Phasen der Probe vor Annealing tritt noch eine weitere Phase, Phase B, mit einem lamellaren Wiederholabstand von 42,26 Å auf. Da Studien zu SA-Monolayern eine Schichtdicke von etwa 21 Å aufzeigen^{106, 107}, könnte diese Phase sepa-rierter SA zugeordnet werden. Zudem ist bereits beschrieben, dass es in SC-Lipid-mischungen zu einer Separierung von CER und FFA kommen kann¹⁰⁸, was in diesem Fall durch die zusätzlich eingebrachte Energie begünstigt worden sein könnte. Normalerweise würden wir als Folge des Annealing keine Phasenseparation erwarten. In diesem Fall kann jedoch die geringe Luftfeuchtigkeit eine große Rolle gespielt haben, da die in der Literatur beschriebenen Messungen von annealten Proben bei einer relativen Luftfeuchte von 60 bis 100 % durchgeführt wurden. Letztendlich können mit Hilfe der vorhandenen Daten nur Spekulationen über eine mögliche Zusammensetzung der einzelnen Phasen vorgenommen werden. Für eine Bestätigung dieser wären weiterführende Untersuchungen, beispielsweise NR-Messungen mit einzelnen perdeuterierten Lipidspezies notwendig. Nichtsdestotrotz konnte gezeigt werden, dass ein Annealing von multilamellaren Proben zur Ausbildung einer hochgeordneten Lipidstruktur führt.

Vergleicht man schließlich oligolamellare und multilamellare Lipidmodelle miteinander, lassen sich zwei wesentliche Unterschiede feststellen. Zum einen kann bei oligolamellaren Lipidschichten keine Phasenseparation einer einzelnen Lipidkomponente beobachtet wer-den, weshalb eine homogene Mischung aller Lipidspezies angenommen wird. Die Lipide in multilamellaren Proben liegen dagegen nicht homogen gemischt vor und es tritt eine Pha-senseparation von CHOL (34 Å) und SA (42 Å) auf. Zum anderen hat das Annealing in beiden Modellen unterschiedliche Effekte. Für multilamellare Modelle ist die Durchführung eines Annealingprozesses essentiell, um die lamellare Lipidorganisation zu verbessern⁵. In diesem Fall existiert innerhalb der zu hunderten übereinander gelagerten, relativ ungeordne-

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39 ten Lipidbilayern ein sehr großes Bestreben zur Ausbildung einer besser geordneten Struk-tur. Bei oligolamellaren Proben führt das Annealing zu einem eher gegenteiligen Effekt, bei dem sich die Ordnung der Lipide tendenziell sogar verschlechtert. Da bei der Rotationsbe-schichtung bereits hochgeordnete dünne Lipidschichten entstehen, besitzen diese ein ge-ringes Bestreben eine noch höhere Ordnung zu erreichen. Durch die zusätzlich eingebrachte Luftfeuchte und thermische Energie werden die Lipide stattdessen mobiler und bilden eine weniger geordnete Struktur.