Verbesserung der Expressionsmenge durch Verwendung der drei In-

Viele kernkodierte Gene aus C.reinhardtii enthalten mehrere kleine Introns. Es wurden auch schon Gene ohne Introns beschrieben, allerdings scheinen Introns im allgemeinen eine wichti-ge Rolle bei der Genexpression zu spielen [Fischer N. and Rochaix J.D., 2001]. Gruber et. al.

konnten für die mehrzellige Grünalge Volvox carteri zeigen, dass die Expression von nitA -cDNA durch Einführen von Introns erhöht wird. Weiterhin konnten sie beobachten, dass bei Transformation mit Intron enthaltenden Plasmiden bessere Transformationsraten erzielt wurden [Gruber H. et al., 1996]. Lumbreras et. al. haben beschrieben, dass das Einbringen von Intron 1 desrbcS2Gens in die Mitte und / oder den Anfang desble- Gens nicht nur die absolute

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sion erhöht, sondern auch zu einer verbesserten Transformationsrate führt. Das Intron 1 enthält einen transkriptionellen “Enhancer”, der seine Funktion auch dann ausübt, wenn das Intron vor dem Start - Codon integriert wird. Dabei ist die Aktivität von der Orientierung des Introns un-abhängig [Lumbreras V. et al., 1998]. Anhand einer modifizierten Acetolactat Synthase - cDNA (Mutation des Aminosäurerestes Lysin257 zu Threonin führt zur Resistenz gegen das Herbizid Sulfomethuronmethyl = SMM) haben Kovar et.al. gezeigt, dass nur in Anwesenheit endogener Introns SMM resistente Transformanten generiert werden können [Kovar J.L. et al., 2002].

Das in dieser Arbeit verwendete Ausgangskonstrukt pAES4 enthält im Promotorbereich bereits einmal die Intron 1 - Sequenz des rbcS2- Gens. Um die Expressionsrate weiter zu erhöhen, wurden zwei weitere Kopien der Intron 1 - Sequenz eingeführt (pAES13). Das physiologische rbcS2 -Gen in C.reinhardtiienthält drei unterschiedliche Introns. Zur Funktion von Intron 2 und Intron 3 ist bisher nichts beschrieben. Um zu testen, ob Intron 2 und Intron 3 ebenfalls einen Einfluß auf die Expression des Transgensars-crLuc ausüben, wurde noch ein weiteres Konstrukt hergestellt, in welchem diese beiden Introns zusätzlich integriert wurden (pAES14, vgl. Abb. 14 in Kapitel 2.7). Die Konstrukte wurden aufgrund der in Kapitel 3.1.3 diskutierten Ergebnisse in einen Vektor mit integriertemarg7.8Selektionsmarker kloniert. Alle drei Kon-strukte führten erwartungsgemäß zur Expression und Sekretion funktioneller cRLuc in≥46%

der Algentransformanten. Das bedeutet zunächst, dass zumindest das in die Mitte descrLuc -Gens eingeführte Intron 1 bzw. Intron 2 korrekt durch Spleißen entfernt wurde, sonst wäre ein inaktives C - terminal verkürztes Protein entstanden, da eine Verschiebung des Leserahmens aufgetreten wäre.

Bei den Ergebnissen der Transformantenanalyse durch Lumineszenzmessungen fällt folgen-des ins Auge (vgl. Abb. 24): Das Einführen zusätzlicher Introns macht sich in einer Verschie-bung zu besser lumineszierenden Transformanten bemerkbar. Bei Transformation mit dem Aus-gangskonstrukt ohne zusätzliche Introns (= pAES12: nur 1x Intron 1 im Promotor) findet man eine maximale Lumineszenz von ca. 51000 RLU. Bei Transformation mit dem Konstrukt, in welchem zusätzlich zweimal Intron 1 integriert wurde (= pAES13), findet man eine maxi-male Lumineszenz von ca. 95000 RLU. Bei Transformation mit dem Konstrukt welches In-tron 1, InIn-tron 2 und InIn-tron 3 enthält (= pAES14), findet man mehrere Klone mit Lumineszenz

>100000 RLU und sogar einen Klon mit Lumineszenz >200000 RLU.

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1000-1000010000-2000020000-3000030000-4000040000-5000050000-6000060000-7000070000-8000080000-9000090000-100000100000-150000150000-200000

>200000

Abbildung 24:Verteilung der Lumineszenzaktivitäten der lumineszierenden Transformanten cw15arg⁻A/pAES12 (keine zusätzlichen Introns); cw15arg⁻A/pAES13 (+ 2x Intron 1); und cw15arg⁻A/pAES14(+ Intron 2 und Intron 3). Expressionskassetten siehe Abb. 14.

Die Berechnung der mittleren Aktivität aller lumineszierender Klone sowie die Messung der relativen Aktivität (durch zusätzliche Messung und Einbeziehung der Absorption = Zelldichte) reproduzierte diese Ergebnisse und zeigt deutlich den positiven Einfluß der zusätzlich einge-führten Introns auf die Genexpression. Das Einbringen von zwei zusätzlichen Intron 1 - Sequen-zen (pAES13) führte im Vergleich zum Ausgangskonstrukt pAES12 nur zu einer Verbesserung der Aktivität um den Faktor 1,6 - 1,9. Das Einführen von zusätzlichen Sequenzen für Intron 2 und Intron 3 (pAES14) führte zu einer Verbesserung der Aktivität um den Faktor 3,0 - 4,5.

Es konnte mit Hilfe der Konstrukte pAES12, pAES13 und pAES14 gezeigt werden, dass die Expression eines Gens durch Einführen von Introns erhöht werden kann. Dabei ist eine Kom-bination aus Intron 1, Intron 2 und Intron 3 des rbcS2 - Gens (vgl. pAES14) besser als eine dreimalige Verwendung von Intron 1 (vgl. pAES13). Daraus kann man schließen, dass auch In-tron 2 und 3 desrbcS2- Gens einen verstärkenden Einfluß auf die Expression von Transgenen inC.reinhardtiiausüben. Eine Verbesserung der Transformationsrate konnte hierbei nicht de-tektiert werden. Zur genaueren Analyse der Funktion der beiden Introns müßten aber neue Kon-strukte erzeugt werden, die jeweils nur eins der beiden Introns (ein - oder zweimal integriert) enthalten. Weiterhin müsste getestet werden, ob die zusätzlichen Introns zu einer Verbesserung der Transkription des Gens führen (“Enhancer”) oder ob die verbesserte Expression auf eine effektivere RNA - Prozessierung zurückzuführen ist. In dieser Arbeit wurden keine genaueren Analysen durchgeführt, um herauszufinden, warum die Kombination aus Intron 1 + Intron 2 +

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Intron 3 besser funktioniert, als die Kombination aus dreimal Intron 1. Es kann nur spekuliert werden, dass den unterschiedlichen Introns verschiedene Aufgaben bei der Genregulation zu-kommen und die natürlich vorzu-kommende Kombination aus allen drei Introns desrbcS2- Gens dadurch auch am Besten für die Expression von Transgenen geeignet ist¹¹. Möglicherweise spielt die Sequenz von Intron 3 eine Rolle bei der Bildung des polyA - Schwanzes der mRNA.

Es wurde beispielsweise für Säugerzellkulturen beschrieben, dass das Entfernen der Sequenz des letzten Introns zur Abnahme der mRNA Stabilität und einem verschlechterten Export der mRNA aus dem Zellkern in das Cytoplasma führt [Nesic D. et al., 1993]. In diesem Fall enthält das letzte Intron Informationen, die als Signal für die Polyadenylierung der mRNA dienen.

Für alle weiteren Experimente wurden Plasmide generiert, die zusätzlich zum Intron 1 im Pro-motor noch die Sequenzen für Intron 2 und Intron 3 enthielten.

3.1.5 Vergleich der gemessenen Aktivitäten intra- und extrazellulär lokalisierter cRLuc