2.3 Expressionsplasmide für Fusionsproteine
2.3.1 pAES5 = Expression vonsg1als Fusion mitcrLuc
Beisg1handelt es sich um die Sequenz des 810bp langen H398 scFv - Fragments8 aus Maus.
Aufgrund der unpassenden Restriktionsschnittstellensituation wurde die bereits im Gen mit-gelieferte N - terminale Leadersequenz (Leadersequenz des prokaryontischen ompA - Gens, welche für die Sekretion des Proteins aus der Zelle heraus verantworlich ist) und nicht die ars- Exportsequenz verwendet.sg1wurde als Fusionsprotein mitcrLuckloniert. Zwischen die beiden Proteine wurde eine Faktor Xa - Proteaseschnittstelle eingebaut, um nach erfolgreicher Expression und Reinigung die Luciferase vom Fusionsprotein abspalten zu können (vgl. Abb.
8).
Abbildung 8: (a) Expressionskassette pAES5: Fusionsgen sg1-crLuc, zwischen den Genen befindet sich eine Faktor Xa - Schnittstelle; (b) ExpressionskassettepAES6: Fusionsgen sg3-crLuc, zwischen den Genen befindet sich eine Faktor Xa - Schnittstelle. Klonierung siehe Ka-pitel 5.10.5f.
Das Plasmid pAES5 wurden zusammen mit dem Selektionsmarkerplasmid pArg7.8 in C.reinhardtii cw15arg−Akotransformiert. 180 prototrophe Klone wurden im Luminometer ana-lysiert. Es wurde keine deutlich lumineszierende Transformante gefunden. Aus diesem Grund wurde für weitere Expressionsexperimente ein codonoptimiertessg1≡sg3verwendet, welches freundlicherweise von der Firma Entelechon zur Verfügung gestellt wurde.
8single chain Fragment variable region≡Teil des Antikörpers, der für die Erkennung des Antigens verantwortlich ist. Die Sequenz wurde vom Fraunhofer Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (FhIGB); Stuttgart zur Verfügung gestellt.
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2.3.2 pAES6 = Expression vonsg3als Fusion mitcrLuc
Beisg3handelt es sich um die an die Codon Usage vonC.reinhardtiiangepasste Sequenz des H398 scFv - Fragments (vgl. auchsg1in Kapitel 2.3.1). Hierbei wurde diears- Leadersequenz aus C.reinhardtii für den Export des Proteins ins Kulturmedium genutzt. Die N - terminale ompA - Leadersequenz wurde bei der Klonierung nicht in den neuen Vektor überführt. sg3 wurde (wie auchsg1in pAES5) als Fusion mit crLuckloniert. Zwischen die beiden Proteine wurde wiederum eine Faktor Xa - Schnittstelle eingebaut (vgl. Abb. 8).
Das Plasmid pAES6 wurden zusammen mit dem Selektionsvektor pArg7.8 in C.reinhardtii cw15arg−A kotransformiert. 130 prototrophe Klone wurden im Luminometer analysiert. Es wurden 8 Klone (= 6%) gefunden, die bei Vergleich mit der untransformierten Kontrollkultur eine erhöhte Lumineszenz aufwiesen:
Lumineszenz der Klone zwischen 1434 - 15301 cpm
Lumineszenzcw15arg-Ain TAP 556 cpm
Lumineszenz TAP 778 cpm
Dieses Ergebnis zeigt deutlich, dass die Optimierung der Gensequenz für die Expression re-kombinanter Proteine in der GrünalgeC.reinhardtiivon großer Bedeutung ist.
Die nähere Analyse von ausgewählten Transformanten im Szintillationszähler ergab scheinbar den Verlust der Lumineszenz in der transgenen Algenkultur. Allerdings ließ sich Lumineszenz in derselben Probe im Lumineszenz Reader weiterhin nachweisen, d.h. bei niedriger Expression ist die Messung im Szintillationszähler ungeeignet, da die schwachen Signale im Hintergrund-rauschen "untergehen".
Die Transformantecw15arg−A/pAES6/pArg7.8-2B4wurde im 1l - Maßstab in TAP - Medium angezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation vom Medium abgetrennt. Lumineszenz-messungen ergaben, dass sich die Lumineszenzaktivität des Fusionsproteins zu ca. 50% im Kul-turüberstand befand (Daten nicht gezeigt). Die Proteine aus 20ml des KulKul-turüberstand wurden mittels einer Amicon Rührzelle (die Größe von Sg3-cRLuc beträgt ca. 65 kDa, Ausschlußgröße der verwendeten Membran: 30 kDa) aufkonzentriert. Das Endvolumen betrug ca. 1,5ml; d.h. die Probe wurde um den Faktor 13 aufkonzentriert. Vergleicht man dagegen die Lumineszenzwerte der gemessenen Fraktionen untereinander, so findet sich nur ein Aufkonzentrierungsfaktor von cirka 5. Möglicherweise ist ein Teil des Proteins während der Aufkonzentrierung denaturiert.
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Durchlauf Amicon 501721 0.7 ≤Hintergrund
Konzentrat Amicon 6524458 9,6
Hintergrund TAP 676491 1,0
Weiterhin wurden 100ml des Überstandes einer fraktionierten Ammoniumsulfatfällung unter-zogen. Dabei konnte aktive Luciferase jedoch in keiner der Fraktionen angereichert werden.
Möglicherweise stört das Ammoniumsulfat die Aktivität des Proteins (die Proben wurden vor Lumineszenzmessung nicht dialysiert). Die resuspendierten Präzipitate nach der 20%; 40%
und 100% Ammoniumsulfatsättigung wurden zusätzlich noch über SDS - PAGE analysiert.
Es konnte aber in keiner Fraktion eine Anreichung von (inaktivem) Protein der richtigen Größe nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
Das Fusionsprotein Sg3-cRLuc weist einen pI von ca. 5,67 auf. Daher würde man erwar-ten, dass das Protein bei pH > 6 negativ geladen ist und an eine Anionenaustauscher bin-det. Reinigungsversuche mit ins Medium sezernierter cRLuc (pI = 5,6397, Transformante cw15arg−A/pAES4/pArg7.8, pH≥7) hatten allerdings gezeigt, dass das Protein nicht an einen Anionenaustauscher bindet (Dr. M. Fuhrmann, persönliche Mitteilung). Aus diesem Grund wurde versucht, das Fusionsprotein über einen Kationenaustauscher zu reinigen (vgl. Kapitel 5.11.2).
Die Messung der Lumineszenz im Durchlauf ergab, dass das Fusionsprotein Sg3-cRLuc an den Kationenaustauscher zu binden schien. Allerdings konnte in keiner der eluierten Fraktionen si-gnifikante Lumineszenz, geschweige denn eine Anreicherung der Aktivität nachgewiesen wer-den (Daten nicht gezeigt). Möglicherweise ist das Protein während der Säulenchromatographie denaturiert. Von den einzelnen Elutionspeaks wurde jeweils 1 ml der gesammelten Fraktionen mit TCA gefällt. Das gesamte Präzipitat wurde anschließend in 1x SDS - Probenpuffer resus-pendiert und auf einem 12% SDS - Polyacrylamidgel analysiert. In den Fraktionen 39 und 40 (Elution mit 500mM NaCl in 10mM KH2PO4/K2HPO4) fand man eine schwache Bande von ca. 68kDa, die in ihrer Größe dem gesuchten Fusionsprotein entsprechen würde. Die Bande korreliert allerdings nicht mit einer Anreicherung der Aktivität (Daten nicht gezeigt).
In den bisher beschriebenen Experimenten war es nicht gelungen, cRLuc bzw. Sg3-cRLuc im Kulturüberstand der entsprechenden Transformanten über SDS - PAGE oder durch Western Blot Analyse nachzuweisen. Möglicherweise war die Menge des exprimierten Proteins zu ge-ring. Aus diesem Grund wurde in den nächsten Schritten versucht, die Koexpressionsrate zu