5 Ergebnisse und Diskussion
5.1. Optimierung der Synthese von fC‐ und caC‐haltiger DNA
5.1.8. Verbesserter fC‐Baustein für die Festphasensynthese
Das Design des verbesserten fC‐Monomers erfolgte auf der Grundlage der Standard‐Bedingungen während der DNA‐Synthese. Die Reaktivität des fC‐Bausteins wird vermutlich vorrangig durch die elektronenziehende Formylgruppe und den daraus resultierenden elektronenarmen Heterozyklus geprägt. Eine Maskierung der Formylgruppe sollte daher die Mesomerie des Akzeptorsystems stören und so die Reaktivität reduzieren. Als weiteres Kriterium wurde die Kompatibilität mit der etablierten Phosphoramidit‐Syntheseroute85 analog Schema 2d) und e) festgelegt.
Abbildung 25: Geplante Schutzgruppenstrategie für die Herstellung des verbesserten fC‐Monomers. Dabei soll die in 5‐Position befindliche Formylgruppe durch eine Schutzgruppe maskiert werden, sodass sie keinen störenden Einfluss auf die DNA‐Synthese nimmt und nach der Synthese einfach regeneriert werden kann.
Um diese Eigenschaften in einem Molekül zu vereinigen, wurde die Maskierung des Aldehyds als Acylal angestrebt, diese Reaktion ist in Schema 5 dargestellt.
Schema 5: Acylal geschütztes fC‐Nukleosid. Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Diese Reaktion wird durch die Einwirkung von Essigsäureanhydrid und geeigneter Katalysatoren wie zum Beispiel TMSCl, NaI, Iod, Schwefelsäure, NBS, ZnCl2 oder FeCl3 ermöglicht.101 Die Reaktionsbedingungen für diese Umsetzungen werden in Tabelle 2 zusammengefasst.
Unter den gewählten Bedingungen konnte das Acylal jedoch nicht erhalten werden. Möglicherweise verhindert das konjugierte Elektronensystem den nukleophilen Angriff am Carbonyl‐Kohlenstoff indem es eine intermediär auftretende positive Ladung über den Heterozyklus kompensiert.
Als weitere Alternative wurde die Schützung als Acetal evaluiert. Acetale werden im Sauren gespalten, ermöglichen aber durch ihre vielfältigen Substitutionsmöglichkeiten eine Feinjustierung der chemischen Reaktivität. Diesbezüglich wurden zyklische und azyklische Acetale untersucht.
Um eine gleichzeitige Einführung geeigneter Schutzgruppen am exozyklischen Amin als auch an der Formylgruppe zu ermöglichen wurde die Reaktion des Nukleosids mit Dimethylformamidinacetalen untersucht. Die Reaktion ist in Schema 6 illustriert.
Diese Eintopf‐Umsetzung führt in einem Reaktionsschritt die in der Oligonukleotidsynthese häufig eingesetzte DMF‐Schutzgruppe ein und ermöglicht zudem eine Maskierung des Aldehyds.
Reaktionsbedingungen sind in der Tabelle 2 aufgeführt. Das entstehende Produkt weist einen weniger elektronenarmen Heterozyklus auf und sollte so die glykosidische Bindung gegenüber sauren Bedingungen oder Nukleophilen stabilisieren.
Schema 6: Die zweifache Schutzgruppenstrategie für das fC‐Monomer.
Die unterschiedlichen Reaktionsführungen (Tabelle 2) und Schutzgruppen lieferten in allen Fällen nur geringe bis mäßige Ausbeuten und zeigten zum Teil eine Zersetzung des Startmaterials. Aus diesem Grund musste eine alternative Strategie gewählt werden.
Diese basiert auf einer schrittweisen Einführung der beiden Schutzgruppen am Heterozyklus.
Zunächst sollte die Formylgruppe durch Einführung eines zyklischen Acetals maskiert werden um in einem zweiten Schritt die Aminofunktion mit einer Benzoylschutzgruppe zu blockieren (Schema 7).
Schema 7: Alternative Syntheseroute über ein zyklisches Acetal mit anschließender Einführung eines Benzylamids
Letztlich konnte die in Tabelle 2 gelisteten Reaktionsführungen im Falle von Ethandiol als Nukleophil nur sehr geringe Mengen des Produkts liefern. Bessere Ergebnisse lieferte Propandiol, welches durch
Acetalbildung einen Sechsring erzeugt. Dieser Dialkohol konnte bereits als Schutzgruppe in der Festphasensynthese eingesetzt werden.102 Allerdings wurde die Stabilität der Schutzgruppe in genannter Arbeit nicht belegt, da auch freie Aldehyde in der Regel mit der Festphasensynthese kompatibel sind. Diese Kompatibilität wirkt sich bei einer teilweisen Spaltung des Acetals während der Detritylierung günstig aus.103,104
Die Optimierung der Reaktionsbedingungen wurde gemeinsam mit Arne Schröder im Arbeitskreis Prof. Carell durchgeführt. Dabei lieferte ausschließlich die Verwendung von TiCl4 als Lewissäure gute Ergebnisse.105
Ausgangsverbindung Zielverbindung Reagentien und
Bedingungen Ergebnis 1
Ac2O, H2SO4 (katalytisch), 3 h, RT
Keine
Produktbildung
2 Ac2O, FeCl3 (katalytisch), 1 h,
0 °C
Keine
Produktbildung
3 Ac2O, ZnCl2 (katalytisch), 1 h,
0 °C
Keine
Produktbildung
4 Ac2O, I2 (katalytisch), 3 h, RT Keine
Produktbildung
5
Propandiol,
Triethylorthoformiat, Tetrabutylammonium‐
bromid, 16 h, RT
Keine
Produktbildung
6 Propandiol, Amberlite IR120,
72 h, RT, Benzol
Produktbildung (Spuren)
7 Propandiol, CeCl3
(katalytisch), 16h, RT
Produktbildung (Spuren) 8
Propandiol,
p‐Toluolsulfonsäure, 14 h, Reflux, Benzol
Produktbildung (Spuren)
9
Ethandiol,
p‐Toluolsulfonsäure, 14 h, Reflux, Benzol
Produktbildung (Spuren)
Ausgangsverbindung Zielverbindung Reagentien und
Bedingungen Ergebnis 10
N,N‐Dimethylformamid‐
dimethylacetal, Molsieb 3 Å, 16 h, 60 °C, Methanol
Produktbildung (Spuren) 11
N,N‐Dimethylformamid‐
diethylacetal, Molsieb 4 Å, MeOH, 36 h, RT
unvollständiger Umsatz
12 2‐N,N‐Dimethylamino‐1,3‐
dioxan, Aceton, 36 h
Produktbildung (Spuren)
13
2‐N,N‐Dimethylamino‐1,3‐
dioxan, p‐Toluolsulfonsäure, Propandiol, Toluol, 70 °C, 16 h
Produkt wurde im Gemisch mit Edukt erhalten
14
2‐N,N‐Dimethylamino‐1,3‐
dioxan, p‐Toluolsulfonsäure, Propandiol,
Triethylorthoformiat, 60 °C, 72 h
Produkt wurde im Gemisch mit Edukt erhalten
15
CeCl3, Triethylorthoformiat, EtOH, 48 h
unvollständiger Umsatz, Produkt isoliert
16 CeCl3, Triethylorthoformiat,
Propandiol, 48 h
unvollständier Umsatz, Produkt isoliert
Tabelle 2:Zusammenfassung der Reaktionsbedinungen für die Umsetzung des fC‐Nukleosids zum Acylal sowie Acetal.
Die darauffolgende Etablierung der Aminoschutzgruppe wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr angestrebt. Die Arbeit wurde von Arne Schröder (Arbeitskreis Prof. Carell) fortgesetzt. Dabei fand er heraus, dass die Benzoyl‐Schutzgruppe am Amin eine Methoxysubstitution in para‐Stellung erfordert um die Stabilität der Schutzgruppe zu erhöhen. Die typischerweise eingesetzte Benzoylschutzgruppe erwies sich in diesem System als zu instabil.
Der Baustein (Abbildung 26) wurde im Arbeitskreis Carell vollständig geschützt hergestellt und in DNA‐Stränge eingebaut.105
Abbildung 26: Die neueste Generation des fC‐Monomers für die automatisierte Festphasensynthese liefert bisher unerreichte Reinheit des Rohprodukts und ermöglicht daraus resultierend ausgezeichnete Ausbeuten
Mit diesem Baustein konnte durch Arne Schröder (Arbeitskreis Prof. Carell) erstmals DNA hergestellt werden, die sequenztreu und hochspezifisch alle epigenetisch relevanten Derivate des Desoxycytidins enthält. Darüber hinaus liefert der Baustein hervorragende Ausbeuten bei der DNA‐
Synthese und ermöglicht hochreine RP‐Chromatogramme nach Abspaltung der Schutzgruppen. Die oben beschriebenen, idealen Eigenschaften eines Monomers konnten auf diese Weise in einem Phosphoramidit‐Baustein realisiert werden. Der Baustein ist aufgrund seines robusten Designs und der beispiellosen Qualität der synthetischen DNA auch bei kommerziellen Anbietern, wie Glen Research (Katalognummer 10‐1564) und Link (Katalognummer 2548) von hohem Interesse.