3.1.1 Konzept
Durch das Verfahren des Elektrospinnens ist ein einfacher Zugang zu Fasern im Bereich von Mikrometern bis hinab zu wenigen Nanometern gegeben. Durch die Immobilisierung von Bakterien in solchen Faservliesen sollte es möglich sein, falls ein Kontakt der Bakterien in den Fasern mit dem umgebenden Medium gegeben ist, eine biologisch aktive Membran herzustellen. Auch die Stabilität und das hohe Verhältnis von Oberfläche zum Volumen einer solchen Membran sprechen für eine solche Verwendung.
Im Zuge vorangegangener Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass es möglich ist durch das Verspinnen mit Bakterien angereicherter, wässriger Lösungen von Polyethylenoxid und Polyvinylalkohol Bakterien enthaltende Faservliese zu erzeugen. Die Untersuchungen zeigten, dass die Bakterien in der Lage waren, den eigentlichen Spinnprozess in großer Zahl zu überstehen. Zumindest im Falle von M. luteus konnte auch nachgewiesen werden, dass in den Faservliesen, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert wurden, noch nach mehreren Tagen lebende Bakterien vorhanden waren.[8]
Von diesen Grundlagen ausgehend wurden die Überlebensraten von E. coli und M. luteus in Faservliesen aus PEO 900.000 näher untersucht.
3.1.2 Überlebensfähigkeit in Faservliesen
Die Experimente wurden analog den vorangegangenen Untersuchungen durchgeführt.
Einer wässrigen Lösung von PEO 900.000 wurde direkt vor dem Verspinnen 10 % einer Flüssigkultur von E. coli oder M. luteus zugegeben, deren OD578 zuvor bestimmt worden war (siehe Tabelle 3-1). Da sich E. coli auch bei diesem Experiment wieder als äußerst fragil erwies, wurde bei der Probe MG081206 die Konzentration an Bakterien stark erhöht,
Ergebnisse und Diskussion
_________________________________________________________________________
Tabelle 3-1: Zusammensetzung der Bakterien enthaltenden Polymerlösungen.
Probe Polymerlösung Zugabe Kultur / % Bakterienart OD578
MG151106 5 % PEO in H2O 10 M. luteus 1,0
MG271105a 5 % PEO in H2O 10 M. luteus 0,8
MG271105b 5 % PEO in H2O 10 E. coli 1,0
MG081206 5 % PEO in H2O 10 E. coli 2,7
Tabelle 3-2: Verarbeitungsbedingungen beim Verspinnen der Proben.
Probe E / kV cm-1 d / cm Durchfluss / mL h-1
MG151106 0,7 20 0,51
MG271105a 0,9 15 0,51
MG271105b 0,9 15 0,51
MG081206 0,9 15 0,51
Gesponnen wurde direkt in sterile Glaspetrischalen. Durch das hohe Gewicht der Glaspetrischalen und das äußerst geringe Gewicht der Faservliese im Bereich von wenigen Milligramm war eine genaue Bestimmung der Masse der erzeugten Proben nicht möglich.
Um dennoch eine Vergleichbarkeit der Proben bezüglich der Menge der versponnenen Polymerlösung zu gewährleisten, wurde bei stets gleicher Geschwindigkeit des Schrittmotors der Anlage exakt fünf Minuten in eine Schale gesponnen. Dies entsprach einer Menge an Polymerlösung von 0,04 mL. Während der Präparation der Proben herrschte eine Temperatur von 21 bis 22 °C, die relative Luftfeuchtigkeit lag zwischen 55 und 65 %.
Es wurden je rund 30 Proben hergestellt. Die beiden M. luteus enthaltenden Proben wurden bei verschiedenen Temperaturen gelagert, MG151106 bei Raumtemperatur und MG271106a bei vier Grad Celsius. Die E. coli enthaltenden Proben wurden jeweils in eine bei Raumtemperatur und eine bei vier Grad Celsius gelagerte Fraktion aufgeteilt. Alle Proben wurden in der Dunkelheit gelagert. Zu gegebener Zeit wurden jeweils drei Proben einer Serie in ihren Petrischalen durch Zugabe von sterilem Kaliumphosphatpuffer aufgelöst. Diese Lösungen dienten als Ausgangspunkt von Verdünnungsreihen.
Ausplattieren einer definierten Menge der Lösungen auf Agarplatten und anschließendes
Ergebnisse und Diskussion
_________________________________________________________________________
Inkubieren lieferte die Zahl lebender Zellen in den Fasermatten zum Zeitpunkt des Auflösens. Die Resultate werden in Tabelle 3-3 und Tabelle 3-4 sowie in Diagramm 3-1 und Diagramm 3-2 veranschaulicht.
Tabelle 3-3: Lebendzellzahlen und Lagerungszeiten von M. luteus bei Raumtemperatur und vier Grad Celsius bezogen auf 0,04 mL Lösung.
MG151106 MG 271106a
Lagerungszeit / h LZ Lagerungszeit / h LZ
Lösung 137300 Lösung 35300
1,0 86400 ± 5000 4,0 22300 ± 4800
28,5 66500 ± 15500 28,0 9300 ± 6400
53,0 50400 ± 9000 52,0 17300 ± 4700
73,0 20200 ± 4500 73,0 11000 ± 2200
100,0 3200 ± 1900 97,0 12800 ± 4500
124,0 2300 ± 400 121,0 16300 ± 2100
145,0 600 ± 400 169,5 14000 ± 2300
169,5 1000 ± 270 193,5 16600 ± 2700
- - 217,5 17400 ± 4300
- - 243,0 10500 ± 4000
- - 313,0 15500 ± 3500
Tabelle 3-4: Lebendzellzahlen und Lagerungszeiten von E. coli bei vier Grad Celsius bezogen auf 0,04 mL Lösung.
MG271106b MG081206
Lagerungszeit / h LZ Lagerungszeit / h LZ
Lösung 432300 Lösung 1231500
1,0 1700 ± 800 0,5 1670 ± 812
28,0 0 23,0 0
56,0 0 46,0 0
Ergebnisse und Diskussion
_________________________________________________________________________
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
0 20000 40000 60000 80000 100000
Lebendzellzahl
Zeit / h
M. luteus E. coli
Diagramm 3-1: Auftragung der Lebendzellzahlen gegen die Zeit für die Lagerung bei Raumtemperatur. Die Werte für die Lösungen vor dem Verspinnen sind nicht enthalten.
0 50 100 150 200 250 300 350
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000 24000 26000 28000
Lebendzellzahl
Zeit / h
M. luteus E. coli
Diagramm 3-2: Auftragung der Lebendzellzahlen gegen die Zeit für die Lagerung bei vier Grad Celsius. Die Werte für die Lösungen vor dem Verspinnen sind nicht enthalten.
Es ist deutlich zu erkennen, dass beide Arten von Bakterien das Verspinnen sehr unterschiedlich überstanden. Die in einer vorangegangenen Arbeit gemachten Beobachtungen konnten hierbei bestätigt werden.[8] Die Gram-positiven M. luteus überlebten die Bedingungen während des Verspinnens und einer kurzen Lagerungszeit deutlich besser als die Gram-negativen E. coli. Die beiden M. luteus enthaltenden Proben MG151106 und MG271106a wiesen nach dem Verspinnen und einer Lagerungszeit von einer bzw. vier Stunden noch 63 % der Lebendzellzahl vor dem Verspinnen auf. Im
Ergebnisse und Diskussion
_________________________________________________________________________
Gegensatz dazu betrug der Wert der Lebendzellzahl bei E. coli nach dem Verspinnen nur noch 0,4 % bei MG271106b und 0,1 % bei MG081206, bezogen auf den ursprünglichen Wert.
M. luteus zeigte auch hier wieder einen ständigen Rückgang der Zahl lebender Zellen in den Proben wenn diese bei Raumtemperatur gelagert wurden. Deutliche Unterschiede weist jedoch Diagramm 3-2 auf. Hier stabilisiert sich die Lebendzellzahl bei einer Lagerung bei vier Grad Celsius. Auch nach einer Lagerungsdauer von mehr als 300 Stunden ist kein signifikantes Abfallen des Wertes zu erkennen.
Auffallend sind in diesem Zusammenhang auch die signifikant hohen Standardabweichungen der einzelnen Messpunkte in den Diagrammen. Eine mögliche Hauptursache hierfür liegt in der Präparation der einzelnen Proben. Es kann nicht mit absoluter Sicherheit davon ausgegangen werden, dass die gesamten, während der fünfminütigen Spinnzeit erzeugten Fasern in der Petrischale aufgefangen wurden. Auch kann es besonders im Falle der zur Aggregation neigenden M. luteus zur Bildung von Inhomogenitäten innerhalb der Spinnlösung kommen, so dass eine erzeugte Probe, im Vergleich zu einer anderen, trotz gleicher Menge versponnener Polymerlösung eine andere Zahl Bakterien enthalten könnte.
3.1.3 Zusammenfassung
Es kann an dieser Stelle festgestellt werden, dass die bestehenden Erkenntnisse bezüglich des Verspinnens mit Bakterien angereicherter, wässriger PEO-Lösungen bestätigt und erweitert werden konnten. Sowohl M. luteus, als auch E. coli überstanden das Verspinnen, wenn auch E. coli in weitaus geringerer Zahl. E. coli starb in den Fasermatten schnell ab, M. luteus überlebte, vor allem bei Lagerung bei vier Grad Celsius, mehr als 300 Stunden.
Ergebnisse und Diskussion
_________________________________________________________________________