Untersuchungen zur Funktion des möglichen Formiat-Transporters FocB

Nachdem NirC als Mitglied der FNT-Familie für den Transport von Formiat in vivo ausgeschlossen werden konnte, sollte nun im weiteren Verlauf die Rolle von FocB hinsichtlich des Formiat-Transports untersucht werden. Da das Gen focB von Andrews et al., 1997, bei bioinformatischen Analysen durch seine hohe Sequenzähnlichkeit zu focA als solches bezeichnet wurde, liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei FocB um ein weiteres Formiat-Transportsystem handelt.

Um dies zu untersuchen wurden eine ∆focB-Einzel- und eine FocA^- ∆focB-Doppelmutante mittels P1-Phagentransduktion konstruiert. Als Donorstamm wurde der Stamm JW2477 aus der Keio-Kollection (Baba et al., 2006) verwendet. Als Akzeptorstamm diente für die Einfachmutante der Wildtypstamm MC4100 und für die Doppelmutante der FocA^--Stamm REK701. Die Konstruktion der Mutanten sowie die Insertion des fdhF′-′lacZ-Konstruktes erfolgte ebenfalls wie bei 3.2.1 beschrieben. Die erhaltenen Mutanten wurden mittels Kolonie-PCR auf ihre Korrektheit überprüft.

67 Zunächst sollte nun mit Hilfe des fdhF′-′lacZ Konstruktes eine Aussage über die Änderung der Formiat-Konzentration in der Zelle getroffen werden. Dafür wurden alle Stämme in TGYEP-Medium (pH 6,5 und 0,8 % Glukose) anaerob bis zu einer OD₆₀₀ von etwa 0,6 kultiviert und im Anschluss die β-Galaktosidase-Aktivität bestimmt. Das Ergebnis ist in Abbildung 3.13 dargestellt. Eine ∆focB-Mutante zeigte dabei eine um etwa 40 % verminderte Aktivität gegenüber dem Wildtyp nach der Kultivierung ohne Formiat im Medium. Wurde dem Kultivierungsmedium Formiat zugegeben, verhielt sich die ∆focB-Mutante wie der FocA^--Stamm. Bei der Doppelmutante zeigte sich nach anaerober Kultivierung ohne Zugabe von Formiat eine etwa 90 % gesteigerte Aktivität gegenüber dem Wildtyp bei gleichen Bedingungen. Dies lässt auf eine erhöhte interne Formiat-Konzentration schließen. Diese ergibt sich, da das intern gebildete Formiat durch die Abwesenheit von FocA und FocB nicht mehr aus der Zelle transportiert werden konnte und sich somit anhäufte. Betrachtet man die Aktivität der Doppelmutante nach Anzucht mit Formiat im Medium, so ist festzustellen, dass diese nur eine etwa 30 % verringerte Aktivität gegenüber dem Wildtyp bei gleichen Bedingungen, jedoch eine um etwa 50 % gesteigerte Aktivität gegenüber der Anzucht ohne Formiat im Medium zeigt. Diese Aktivität ergibt sich aus der Anhäufung des intrazellulär gebildeten Formiats zuzüglich des aufgenommenen, welches durch Diffusion oder aber noch ein weiteres Formiat-Transportsystem in die Zelle gelangt sein könnte.

Abbildung 3.13: β-Galaktosidase-Aktivität verschiedener E. coli-Stämme nach anaerober Anzucht in TGYEP-Medium (pH 6,5) zur Untersuchung der Rolle von FocB hinsichtlich des Formiat-Transports.

Grün = ohne Zusatz von Formiat zum Medium; Orange = Zugabe von 20 mM Formiat zum Medium. Der Wildtypstamm DH4100 wurde als Referenzstamm mitgeführt und die entsprechende Aktivität ohne Zugabe von Formiat zum Medium 100 % gesetzt (100 % entsprechen 809 U). Die Messung wurde als Dreifachbestimmung durchgeführt und das Experiment unabhängig voneinander mehrere Male wiederholt. Dabei differierten die absoluten Werte der einzelnen Aktivitäten, jedoch zeigte sich immer dieselbe Tendenz.

68 Mit dem vorangegangenen Experiment konnte gezeigt werden, dass FocB am Formiat-Transport beteiligt ist. Dies wurde vor allem durch die Anhäufung des Formiats in der Zelle, die aus einem gestörten Export resultierte, deutlich. Um nun im weiteren Verlauf zu schauen, ob die gesteigerte Menge an Formiat in der Zelle vom FHL-Komplex auch abgebaut werden kann, wurde die gebildete Wasserstoffkonzentration bei allen Stämmen am Gaschromatographen quantitativ bestimmt. Dafür wurden die Stämme, wie im vorangegangenen Experiment in mit TGYEP-Medium gefüllten Hungate-Röhrchen anaerob kultiviert und beim Erreichen einer optischen Dichte von etwa 0,6 wurde eine Probe aus der Gasphase über dem Medium mit einer Gasspritze entnommen.

Abbildung 3.14: Analyse der Wasserstoffproduktion verschiedener E. coli-Stämme nach anaerobem Wachstum zur Untersuchung der Rolle von FocB hinsichtlich des Formiat-Transports. Die Stämme wurden im Hungate-Röhrchen, gefüllt mit 10 ml TGYEP-Medium mit einem pH-Wert von 6,5 und einem Glukoseanteil von 0,4 %, bei 37 °C bis zu einer OD₆₀₀ von etwa 0,6 kultiviert. Anschließend erfolgte die Probenentnahme direkt aus der Gasphase des Kulturröhrchens. Die gebildete Wasserstoffmenge des Wildtypstammes DH4100 wurde 100 % gesetzt (100 % entsprechen 21,7 nmol). Grün = ohne Zugabe von Formiat bei der Kultivierung, Orange = Zugabe von 20 mM Formiat zum Medium

Die Abbildung 3.14 zeigt die Wasserstoffproduktion der einzelnen Stämme. Dabei wird deutlich, dass alle Mutanten ohne Zugabe von Formiat zum Kultivierungsmedium eine leicht gesteigerte Wasserstoffproduktion gegenüber dem Wildtyp aufwiesen. Im Wildtyp kann Formiat, welches von der Zelle nicht gleich abgebaut werden kann, zur Detoxifizierung der Zelle ins Periplasma transportiert werden und von dort dann später wieder aufgenommen werden (Beyer et al., 2013). Sind nun FocA oder FocB nicht vorhanden, muss die Zelle das gebildete Formiat schnell abbauen um eine zu starke Ansäuerung des Cytoplasmas zu vermeiden. Dies resultierte in einer gesteigerten Wasserstoffbildung. Besonders deutlich wurde dies bei der Doppelmutante, sie erreichte eine annähernd 100 % gesteigerte Wasserstoffkonzentration des Wildtyps bei gleichen Bedingungen. Interessant ist das

69 Ergebnis der Wasserstoffproduktion, wenn alle Stämme Formiat im Medium enthielten. Sie war zwar höher als beim Wachstum ohne Formiat, jedoch unterschied sie sich nicht so stark zwischen den einzelnen Mutanten und dem Wildtyp. Lediglich der FocA^- -Stamm zeigte eine verminderte Wasserstoffkonzentration gegenüber allen anderen Stämmen. Dieses Experiment lässt vermuten, dass der FHL-Komplex in der Zelle limitiert ist und daher unabhängig von der Formiat-Konzentration in der Zelle nur eine bestimmte Konzentration an Formiat umsetzen kann.