Bestimmung der Änderung der internen Formiat-Konzentration mit Hilfe eines

Eine weitere Möglichkeit eine Aussage über die Änderung der internen Formiat-Konzentration in verschiedenen E. coli-Stämmen zu treffen, ist die Messung der β-Galaktosidase-Aktivität eines durch Formiat induzierten lacZ-Konstruktes. Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Konstrukt handelt es sich um eine Fusion des fdhF-Promotors mit dem lacZ-Gen, als fdhF′-′lacZ-Konstrukt bezeichnet, was mit Hilfe des λ-Phagen ins Genom integriert wurde (Diplomarbeit Beyer, 2009). Alle Stämme, welche dieses fdhF′-′lacZ-Konstrukt im Genom tragen, werden fortan vor ihren ursprünglichen Stammnamen mit DH bezeichnet. Der Promotor des fdhF-Gens, welches für die Formiatdehydrogenase H kodiert, wird durch das in der Zelle vorhandene Formiat induziertRossmann et al., 1994). Dabei fungiert Formiat als Effektor und bindet an den Transkriptionsaktivator FhlA, welcher spezifisch cis-regulatorische Sequenzen des 5′-flankierenden Bereichs des fdhF-Gens bindet (Schlensog und Böck, 1990). Durch das im verwendeten Konstrukt sich anschließende lacZ-Gen kann nun mit Hilfe der Messung der β-Galaktosidase-Aktivität eine Aussage über die

54 Transkription des Gens und somit indirekt über die Formiat-Konzentration in der Zelle getroffen werden. Die bisher verwendeten Stämme wurden nun mit Hilfe dieses lacZ-basierten Reportersystems hinsichtlich der Änderung der intrazellulären Formiat-Konzentration untersucht, um Hinweise auf die Zusammenhänge von Formiat-Bildung und -Transport zu erhalten

Abbildung 3.4: β-Galaktosidase-Aktivität nach anaerober Anzucht. (A) Wildtyp DH4100 (B) FocA^- -Stamm DH701. Die Anzucht erfolgte anaerob in TGYEP-Medium mit 0,8 % Glukose bei einem pH-Wert von 6,5. Die Messung wurde als Dreifachbestimmung durchgeführt und das Experiment unabhängig voneinander mehrere Male wiederholt. Dabei differierten die absoluten Werte der einzelnen Aktivitäten, jedoch zeigte sich immer dieselbe Tendenz.

Betrachtet man vergleichend die β-Galaktosidase-Aktivität des Wildtypstammes DH4100 und eines FocA^--Stammes (DH701) nach anaerobem Wachstum in TGYEP-Medium (pH 6,5 und 0,8 % Glukose) ohne Zugabe von Formiat (Abbildung 3.4), so wird deutlich, dass der Stamm ohne funktionstüchtiges FocA eine sechsfach höhere Aktivität aufweist. Beide Stämme sind durch die Anwesenheit von PflB in der Lage Pyruvat zu Formiat umzusetzen. Beim Wildtyp kann selbiges durch FocA aus der Zelle transportiert werden, wohingegen es bei einem FocA^- -Stamm in der Zelle akkumuliert. Weiterhin zeigte sich eine Zunahme der β-Galaktosidase Aktivität mit steigender Formiat-Konzentration im Medium. Dies ist ein Hinweis darauf, dass Formiat aus dem Medium in die Zelle aufgenommen worden sein musste. Dabei konnte vom Wildtyp wesentlich mehr Formiat aufgenommen werden, was in einer höheren Aktivität resultierte. Vergleicht man die Aktivitäten der FocA^- -Mutante ohne und mit 50 mM Formiat im Medium, so konnte fast eine Verdopplung der Aktivität erreicht werden. Da ein gepuffertes Medium mit einem pH Wert von 6,5 verwendet wurde, ist dieser Effekt nicht allein auf Diffusion zurück zu führen, sondern gibt Hinweise auf die Anwesenheit eines weiteren Formiat-Transportsystems in der Zelle.

55 Im vorhergehenden Experiment waren die E. coli-Stämme in der Lage unter anaeroben Bedingungen intrazellulär Formiat aus Pyruvat zu bilden. Im Folgenden sollte nun untersucht werden, wie sich der interne Formiatspiegel ändert, wenn Formiat nicht mehr selbst metabolisiert werden kann. Dafür standen Mutanten zur Verfügung, die entweder eine Deletion im pflB-Gen [DH201 (∆focA ∆pflB) und DH220 (∆pflA ∆pflB)] oder inaktives PflB durch die Deletion der Aktivase pflA synthetisierten (Stamm DH234M1). Die Stämme wurden wie im vorhergehenden Experiment kultiviert und dem Medium kein bzw. 15 mM und 50 mM Formiat zugegeben.

Vergleicht man nun die in Abbildung 3.5 untersuchten Stämme, fällt auf, dass die beiden Stämme DH220 und DH234M1 trotz Anwesenheit von FocA nur einen geringen Teil des Formiats aus dem Medium aufnahmen. Die Aktivität des Stammes DH201 hingegen stieg um das Dreifache in Anwesenheit von 15 mM Formiat gegenüber dem Wachstum ohne Formiat.

Bei gleichen Bedingungen konnte in Abwesenheit von FocA eine höhere Aktivität erreicht werden als in Anwesenheit von FocA, was für eine gesteigerte Formiataufnahme des Stamms DH201 gegenüber den Stämmen DH220 und DH234M1 spricht. Daraus lässt sich erneut schlussfolgern, dass es neben FocA noch ein weiteres Transportsystem in E. coli geben muss, welches in der Lage ist, Formiat über die Cytoplasmamembran zu transportieren. Weiterhin ergibt sich die Fragestellung, unter welchen Bedingungen FocA aktiv ist und ob es einen Zusammenhang zwischen der Formiataufnahme und der Anwesenheit von PflB gibt.

Abbildung 3.5: β-Galaktosidase-Aktivität verschiedener E. coli-Stämme nach anaerober Anzucht. Grün = DH201 (∆focA ∆pflB); Orange = DH220 (∆pflB ∆pflA); Blau = DH234M1 (∆pflA) Die Anzucht erfolgte anaerob in TGYEP-Medium mit 0,8 % Glukose bei einem pH-Wert von 6,5. Die Messung wurde als Dreifachbestimmung durchgeführt und das Experiment unabhängig voneinander mehrere Male wiederholt.

Dabei differierten die absoluten Werte der einzelnen Aktivitäten, jedoch zeigte sich immer dieselbe Tendenz.

56 Betrachtet man in Abbildung 3.5 die einzelnen Stämme nach anaerober Kultivierung ohne Formiat im Medium, so zeigte sich trotz inaktivem PflB bzw. in den Deletionsmutanten eine β-Galaktosidase-Aktivität. Die stärkste Aktivität mit etwa 850 U konnte beim Stamm DH201 gemessen werden. Es war in allen Stämmen das Gen tdcE, welches für die 2-Ketobutyrat-Formiat-Lyase kodiert, vorhanden. Das Genprodukt von tdcE ist in der Lage im überproduzierten Zustand beim Fehlen von PflB dessen Funktion teilweise zu ersetzen (Sawers et al., 1998) und wird ebenfalls von der Aktivase PflA aktiviert (Hesslinger et al., 1998a). Die Stämme DH220 und DH234M1 sind beide im pflA-Gen deletiert. Lediglich der Stamm DH201 kann aktives TdcE besitzen, was in einer erhöhten β-Galaktosidase-Aktivität resultieren könnte. Aus diesem Grund wurden die Stämme DH220 und DH201 zusätzlich im Gen tdcE deletiert und die β-Galaktosidase-Aktivität erneut nach anaerobem Wachstum in TGYEP-Medium (pH 6,5 und 0,8 % Glukose) mit verschiedenen Formiat-Konzentrationen bestimmt.

Abbildung 3.6: β-Galaktosidase-Aktivität verschiedener E. coli-Stämme nach anaerober Anzucht Grün = DH223 (∆pflB ∆pflA ∆tdcE); Orange = DH226 (∆focA ∆pflB ∆tdcE); Die Anzucht erfolgte anaerob in TGYEP-Medium mit 0,8 % Glukose bei einem pH-Wert von 6,5. Die Messung wurde als Dreifachbestimmung durchgeführt und das Experiment unabhängig voneinander mehrere Male wiederholt. Dabei differierten die absoluten Werte der einzelnen Aktivitäten, jedoch zeigte sich immer dieselbe Tendenz.

Durch eine zusätzliche Deletion im Gen tdcE (Abbildung 3.6) wurde eine wesentlich niedrigere β-Galaktosidase-Aktivität nach anaerober Anzucht in TGYEP-Medium ohne Zugabe von Formiat zum Medium erreicht als bei den untersuchten Stämmen in Abbildung 3.5. Dies sollte aus einer geringen intrazellulären Formiat-Konzentration resultieren und bestätigt damit die Hypothese von Sawers et al., 1998, dass TdcE in Abwesenheit von PflB dessen Funktion zum Teil übernehmen kann. Weiterhin zeigte der Stamm DH226 gegenüber dem Stamm DH201 (Abbildung 3.5) nur ein Fünftel der Aktivität in Anwesenheit von 50 mM

57 Formiat. Zwischen den Stämmen DH220 (Abbildung 3.5) und DH223 (Abbildung 3.6) ergab sich kein signifikanter Unterschied hinsichtlich ihrer Aktivität. Dies ist ein weiterer Hinweis, dass der Formiat-Transport durch FocA vorrangig durch PflB reguliert zu werden scheint.

Aber auch TdcE scheint die Formiat-Aufnahme zu regulieren. Da der pH-Wert in beiden Experimenten gleich war, lässt dieses Ergebnis vermuten, dass im Fall von DH201 die Anwesenheit von aktivem TdcE die Aufnahme durch ein weiteres Formiat-Transportsystem begünstigt wird. Dies wird jedoch verhindert, wenn TdcE und PflB im inaktiven Zustand vorliegen.

3.1.4 Der Formiat-Abbau in der Zelle korreliert mit der Formiat-Aufnahme im