PVDF
3.14 Identifizierung physiologischer Substratproteine von bakterieller Identifizierung physiologischer Substratproteine von bakterieller Identifizierung physiologischer Substratproteine von bakterieller Identifizierung physiologischer Substratproteine von bakterieller T
4.1.2 Untersuchungen zum Nachweis von Untersuchungen zum Nachweis von Untersuchungen zum Nachweis von Untersuchungen zum Nachweis von Transglutaminase Transglutaminase Transglutaminase Transglutaminase----S S S Substraten in ubstraten in ubstraten in ubstraten in Agar
Abb.
Abb. Abb.
Abb. 4444....111:::: 1 Untersuchungen zur Inhibierung der Quervernetzung von Untersuchungen zur Inhibierung der Quervernetzung von αUntersuchungen zur Inhibierung der Quervernetzung von Untersuchungen zur Inhibierung der Quervernetzung von αααS1S1S1S1----Casein durch TGase mittels Casein durch TGase mittels Casein durch TGase mittels Casein durch TGase mittels Cadaverin.
Cadaverin.Cadaverin.
Cadaverin. 4 µg αS1-Casein wurden in 50 mM Tris-HCl pH 7,0 mit 0 und 625 µM Cadaverin und 30 mU TGase zwischen 0 und 10 min bei 37°C inkubiert. Silbergefärbtes 12,5%iges SDS-Polyacrylamid-Gel Spur 1: αS1-Casein; Spur 2: αS1-Casein + TGase, 10 ' Inkubation; Spur 3 – 7: αS1-Casein + TGase + 625 µM Cadaverin, 0 '; 1 '; 2 '; 5 ' und 10 ' Inkubation.
4.1.2 4.1.2 4.1.2
4.1.2 Untersuchungen zum Nachweis von Untersuchungen zum Nachweis von Untersuchungen zum Nachweis von Untersuchungen zum Nachweis von Transglutaminase Transglutaminase Transglutaminase Transglutaminase----S S S Substraten in ubstraten in ubstraten in ubstraten in
A B
Abb.
Abb. Abb.
Abb. 4444....222:::: 2 10 Tage alte Oberflächenkulturen10 Tage alte Oberflächenkulturen von 10 Tage alte Oberflächenkulturen10 Tage alte Oberflächenkulturen von von von S. mobaraensiS. mobaraensisS. mobaraensiS. mobaraensisss auf GYM auf GYM auf GYM----Agar auf GYMAgarAgarAgar.... (A) Kontrolle ohne Cadaverin. Kolonien mit weißem Luftmycel sind klar erkennbar. (B) Kultur mit 0,1% Cadaverin. Großflächig fehlt das Luftmycel. Der markierte Bereich ist in Abb. 4.3 herausgehoben.
Abb.
Abb. Abb.
Abb. 4444....333:::: 3 S. mobaraensisS. mobaraensis----Kolonien auf GYMS. mobaraensisS. mobaraensisKolonien auf GYMKolonien auf GYMKolonien auf GYM----Agar miAgar miAgar miAgar mit 0,t 0,t 0,1% Cadaverin (Vergrößerung des in t 0,1% Cadaverin (Vergrößerung des in 1% Cadaverin (Vergrößerung des in 1% Cadaverin (Vergrößerung des in Abb. Abb. Abb. 4Abb. 444....2222 B markierten Bereichs).
B markierten Bereichs).B markierten Bereichs).
B markierten Bereichs). Es ist deutlich zu erkennen, dass die Kolonien kein oder nur stellenweise Luftmycel ausgebildet haben. Wurde dieses gebildet, dann vorwiegend an den äußeren Rändern einer Kolonie.
Aus den Ergebnissen der Oberflächenkulturen wurde geschlossen, dass Cadaverin direkt die Ausbildung des Luftmycels beeinflusst, indem es wahrscheinlich in TGase-Substrate eingebaut wird, die danach nicht mehr als Bausteine der bakteriellen Zellwand fungieren können.
Als nächster Schritt wurde Cadaverin in Flüssigkulturen eingesetzt, um die gesuchten Proteine in hoher Konzentration herzustellen. Da bereits bei den Oberflächenkulturen Auswirkungen des Cadaverins auf das Wachstum festgestellt werden konnten, wurde zunächst die letale Konzentration bestimmt. Dazu wurden dem Medium 0,1% und 1%
Cadaverin vor dem Animpfen zugesetzt, wobei der Kontrollansatz keinen Inhibitor enthielt. Die Inkubation erfolgte in 1-l-Schikanekolben auf einem Querschüttler bei 28°C wie in Abschnitt 3.3.3 beschrieben. Probennahmen erfolgten nach 7, 24, 31, 48, 55 und 72 h. Bereits bei 0,1% Cadaverin im Medium war das Wachstum gegenüber der Kontrolle
kugelförmigen Mycelien (Zotzel 2002) waren wesentlich kleiner. Bei einer Konzentration von 1% fand kein Wachstum mehr statt. Proteine wurden erstmals nach 48 h mittels SDS-PAGE nachgewiesen. Dabei zeigte sich, dass offensichtlich gleiche Proteine im Bereich von 14 – 20 kDa durch den Einfluss des Inhibitors zu einer langsameren Wanderungsgeschwindigkeit bewegt werden, was beim Abbruch der Kultivierung nach 72 h kaum noch erkennbar ist (Abb. 4.4).
Abb.
Abb. Abb.
Abb. 4444....444:::: 4 Untersuchungen zur Kultivierung von Untersuchungen zur Kultivierung von Untersuchungen zur Kultivierung von Untersuchungen zur Kultivierung von S. mobaraensisS. mobaraensisS. mobaraensisS. mobaraensis ohne und mit 0,1% Cadaverin im ohne und mit 0,1% Cadaverin im ohne und mit 0,1% Cadaverin im ohne und mit 0,1% Cadaverin im Flüssigmedium.
Flüssigmedium.Flüssigmedium.
Flüssigmedium. Silbergefärbtes 12,5%iges SDS-Polyacrylamid-Gel des zu verschiedenen Zeiten geernteten Kulturüberstandes (KÜ). Spur 1, 3 und 5: KÜ der Kontrolle nach 48 h, 55 h und 72 h; Spur 2, 4 und 6: KÜ des 0,1% Cadaverin enthaltenden Mediums nach 48 h, 55 h und 72 h. Es ist deutlich die Molekulargewichtsverschiebung der Proteine des cadaverinhaltigen Mediums zu einer höheren apparenten Molmasse zu erkennen.
Aufgrund der Toxizität von 1% Cadaverin auf S. mobaraensis wurden zusätzlich Konzentrationen von 0,01%, 0,05% und 0,2% im Flüssigmedium getestet, um die einsetzbare Obergrenze des Inhibitors zu bestimmen. Als Kontrollansätze dienten jeweils ohne und mit 0,1% Cadaverin angezogene Kulturen. Bei 0,01% Cadaverin im Medium zeigte sich keine Veränderung im Wachstum verglichen mit der Kontrolle ohne Inhibitor.
Die Kulturen mit 0,05% und 0,1% Cadaverin wuchsen eingeschränkt in Form kleinerer Mycelien, wobei es bei letzterer zusätzlich zu einer zeitlichen Wachstumsverzögerung kam. Bei einer Konzentration von 0,2% Inhibitor fand kein Wachstum mehr statt. Die Untersuchung der zellfreien Kulturüberstände mittels SDS-PAGE ergab bei den mit 0,05%
und 0,1% Cadaverin angezogenen Kulturen, verglichen mit der Kontrolle ohne Cadaverin, die bereits beobachtete langsamere Wanderungsgeschwindigkeit offensichtlich gleicher niedermolekularer sekretierter Proteine. Im 0,01% Cadaverin enthaltenden Kulturüberstand wurde keine Veränderung des Proteinmusters festgestellt. Die Toxizitätsgrenze lag somit zwischen 0,1% und 0,2% Cadaverin.
14 - 20 - 29 - 45 - 66 -
kDa 1 2 3 4 5 6
Die Angleichung der Proteinmuster von cadaverinhaltigen Kulturüberständen und Kontrollen nach einer bestimmten Kultivierungszeit legte nahe, dass das Diamin vom Bakterium verbraucht wird und damit seine Wirkung auf TGase verliert. In einem nächsten Schritt wurde der Inhibitor deshalb alle 24 h dem Medium zugefügt. Bei den zellfreien Kulturüberständen mit 0,01% und 0,05% Inhibitor konnten keine wesentlichen Unterschiede im Proteinmuster zur Kontrolle festgestellt werden. Bei regelmäßiger Zugabe von dreimal 0,1% Cadaverin innerhalb von 3 d fand kein Wachstum statt, sodass erst nach dem Anwachsen von S. mobaraensis ohne Inhibitor nach 24 h noch zweimal 0,1% Cadaverin hinzugefügt wurde. Die sezernierten Proteine dieser Kultur entsprachen dem früheren Versuch, bei dem Cadaverin bereits vor dem Animpfen im Medium vorlag.
Zur Feststellung der Substrateigenschaften von Proteinen wurden mit den zellfreien Kulturüberständen Markierungsversuche mit ZQGD, wie in Abschnitt 3.14.2 beschrieben, durchgeführt. Dabei konnten keine fluoreszierenden Banden im Polyacrylamid-Gel detektiert werden. Auch die vorherige Entfernung von Cadaverin, welches die Markierungsreaktion möglicherweise stören könnte, durch fraktionierende Ethanolfällung von 10 – 80 Vol% (Methode 3.5.1) oder Dialyse (Methode 3.5.4) führte nicht zum Nachweis fluoreszierender Proteine.
TGase wird während der Kultivierung von S. mobaraensis durch die Metalloprotease TAMEP aktiviert, die aller Wahrscheinlichkeit nach im Aktivzentrum ein Zinkion gebunden hat. Nachfolgend wurde deshalb untersucht, ob die Aktivierung von TGase und damit eine Modifizierung von Substratproteinen durch ein Nährmedium ohne Spurenelemente, insbesondere ohne Zink, verhindert werden kann. Zusätzlich wurde der Einfluss vom pH des Mediums auf die Vernetzungsaktivität der TGase von S. mobaraensis im Bereich von 4,0 – 8,5 in Abständen von 0,5 pH-Einheiten untersucht. Keine der beiden Versuchsreihen lieferte Kulturüberstände mit markierbaren Proteinen.
Interessanterweise zeigte sich aber, dass S. mobaraensis innerhalb von 24 bis 48 h einen pH von 6 – 7 einstellt. Offensichtlich verfügt das Bakterium über ausgezeichnete Regulationsmechanismen, um bessere äußere Wachstumsbedingungen herzustellen.
Wahrscheinlich reichen auch die über die komplexen Nährstoffe ins Medium eingebrachten Metalle für eine Aktivierung von TGase aus.
Da durch Kultivierung im Flüssigmedium keine TGase-Substrate gewonnen werden konnten, wurde abschließend versucht, markierbare Proteine aus dem Agarmedium von Oberflächenkulturen durch Absaugen der Flüssigkeit mit einem Büchner-Trichter i. Vak.
zu erhalten. Die Experimente wurden mit 10 d alten Kulturen durchgeführt, deren
Medium 0,1% Cadaverin enthielt. Auch dieser Versuch brachte nicht den gewünschten Erfolg.