PVDF
3.14 Identifizierung physiologischer Substratproteine von bakterieller Identifizierung physiologischer Substratproteine von bakterieller Identifizierung physiologischer Substratproteine von bakterieller Identifizierung physiologischer Substratproteine von bakterieller T
3.14.4 Unterdrückung der Quervernetzung durch Unterdrückung der Quervernetzung durch Unterdrückung der Quervernetzung durch Unterdrückung der Quervernetzung durch T TT Transglutaminase ransglutaminase ransglutaminase ransglutaminase mit mit mit mit Cadaverin
Cadaverin Cadaverin Cadaverin
Die Inhibierung der Quervernetzung durch TGase mit Cadaverin wurde am Modellsubstrat Casein in vitro untersucht. Durch den Einbau von Cadaverin erhalten Glutaminreste eine freie Aminogruppe, und TGase kann keine Isopeptidbindung mit den Aminogruppen der Lysine mehr bilden. Die Proteine werden auf diese Weise nicht oder erheblich reduziert vernetzt. Außerdem ist der Einsatz von Cadaverin kostengünstig und macht die Proteine wasserlöslicher. Das kleine Molekül ist außerdem leicht mit den in Abschnitt 3.5 beschriebenen Methoden sowohl aus Kulturüberstand als auch aus in vitro TGase-Reaktionsansätzen zu entfernen. Casein wurde als Modellsubstrat gewählt, da es sich sowohl um ein gutes Lysin- als auch Glutaminsubstrat für TGase handelt und die Inhibitorwirkung von Cadaverin gut verfolgt werden kann. Im Anschluss an die Versuche mit Casein wurde die Unterdrückung der Quervernetzung durch TGase mit Cadaverin während des Wachstums von S. mobaraensis sowohl in Flüssig- als auch auf Agarmedium untersucht.
Die Ansätze zur Unterdrückung der Quervernetzung durch TGase von Casein mittels Cadaverin mit einem Gesamtvolumen von 40 µl hatten folgende Zusammensetzung:
0,1 M Tris-HCl pH 7,0 625 µM – 12,5 mM Cadaverin
30 mU TGase (ca. 3 U/ml)
4 µg Casein oder Dimethylcasein
Als Kontrollen dienten die jeweiligen Ansätze ohne Cadaverin, TGase oder Casein bzw.
Dimethylcasein. Die Inkubation erfolgte bis zu 1 h bei 37°C. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 40 µl Auftragspuffer und Erhitzen für 5 min bei 90°C abgebrochen, und die Mischung wurde mittels Gelelektrophorese getrennt und anschließend wie in Abschnitt 3.8.2 beschrieben silbergefärbt.
4.
4. 4.
4. Ergebnisse Ergebnisse Ergebnisse Ergebnisse
Bakterielle Transglutaminase von S. mobaraensis katalysiert die calciumunabhängige Vernetzung von Proteinen durch Verknüpfung von Glutamin- und Lysinresten unter Bildung von Isopeptidbindungen. Außerdem ist es eines der Hauptproteine, welches das Bakterium bei der Kultivierung in einem flüssigen Komplexmedium ausscheidet. Bei Wachstum auf Agar lässt sich das Enzym erst nach Einsetzen des Lufthyphenwachstums nachweisen (Zotzel 2002). Diese Beobachtungen und der morphologisch komplexe Lebenszyklus des multizellulären Organismus legen die Vermutung nahe, dass das Enzym eine wichtige Rolle in der Zelldifferenzierung, vor allem bei der Bildung des Luftmycels, spielen könnte. Um die biologische Funktion der TGase ermitteln zu können, ist es notwendig, physiologische Substrate des Enzyms zu kennen. Ziel dieser Arbeit war es daher, diese zu identifizieren und zu charakterisieren. Erste Versuche dazu wurden bereits von Pasternack (1997, 1998) mit dansylierten TGase-Substraten unternommen.
Die hier vorgenommenen orientierenden Markierungsversuche von Proteinen eines 3 – 4 d alten Kulturüberstandes mit sensitiverem 5-N-Biotinylamidopentylamin (Monobiotinylcadaverin, MBC) und 1-N-(carbobenzoxy-L-glutaminylglycyl)-5-N-(5’-N’,N’-dimethylaminonaphthalinsulfonyl)diamido pentan (ZQGD) blieben ebenfalls erfolglos.
Frühere Untersuchungen zur Hydrolyse bzw. Deamidierung von ZQGD durch TGase hatten gezeigt, dass diese sehr langsam vonstatten geht (Pasternack et al. 1997). Aus diesem Grund wurde angenommen, dass die Substratproteine bevorzugt im Flüssigmedium als unlösliche Polymere in die Zellwand eingebaut oder bei Abbruch der Kultivierung mit der Zellmasse abgetrennt werden. Diese Annahme wurde durch den Nachweis von mit MBC und ZQGD markierbaren Proteinen in einem Zellwandpolymer gestärkt (Pasternack 1998). Eine Inhibierung der sezernierten TGase während der Flüssigkultur sollte entsprechend die Vernetzung verhindern und damit eine Freisetzung der Substrate in größeren Mengen ermöglichen. Aus diesem Grund musste im Vorfeld eine Methode zur Unterdrückung der enzymatischen Polymerisation gefunden werden, um monomere Substratproteine durch Einsatz eines geeigneten TGase-Inhibitors während der Kultivierung zu gewinnen. Ein weiteres Vorhaben war die proteinchemische und enzymatische Charakterisierung der identifizierten Substratproteine. Die Untersuchungen sollten dazu beitragen, die Funktion der Proteine, aber auch der Transglutaminase besser zu verstehen.
4.1 4.1 4.1
4.1 Unterdrückung der enzymatischen Proteinvernetzung mit Cadaverin Unterdrückung der enzymatischen Proteinvernetzung mit Cadaverin Unterdrückung der enzymatischen Proteinvernetzung mit Cadaverin Unterdrückung der enzymatischen Proteinvernetzung mit Cadaverin 4.1.1
4.1.1 4.1.1
4.1.1 Untersuchungen am Modellsubstrat α Untersuchungen am Modellsubstrat α Untersuchungen am Modellsubstrat α Untersuchungen am Modellsubstrat α
S1S1S1S1----Casein Casein Casein Casein
Für die Unterdrückung der Quervernetzung durch TGase wurde Cadaverin benutzt, da es über seine beiden freien Aminogruppen in reaktive Seitenketten der Glutaminresten von Substratproteinen unter Bildung von Amidbindungen eingebaut werden kann. Dadurch erhalten reaktive Glutamine eine freie Aminogruppe und die Polymerisation wird weitgehend unterdrückt. Nur eine Vernetzung mit einem weiteren Glutamin über das Cadaverinbindeglied sollte in vermindertem Maße möglich sein. Ein großer Vorteil des Inhibitors ist, dass sein Einbau weitere primäre Aminogruppen generiert, die durch die gemeinsame Markierung mit reaktiven Lysinseitenketten die Identifizierung eines Substratmoleküls erleichtern. Mit nur einem Marker (ZQGD oder ZQGB) lassen sich so gleichzeitig Glutamin- und Lysindonorproteine ermitteln. Die Vorversuche zur Bestimmung der Cadaverinkonzentration, die zur Inhibierung der Polymerisation von Substratproteinen mit TGase mindestens nötig ist, wurden mit dem Modellsubstrat αS1-Casein durchgeführt.
Das Milchprotein ist ein gutes Glutamin- und Lysinsubstrat von allen bekannten TGasen.
Zuerst wurde die Abhängigkeit der Inhibierung der Polymerisation von der Cadaverinkonzentration untersucht. Dazu wurden 20 µg αS1-Casein und 0,625 bis 12,5 mM Cadaverin in Gegenwart von 30 mU TGase 1 h bei 37°C inkubiert. Als Kontrolle diente ein Ansatz ohne Cadaverin. Das silbergefärbte Polyacrylamid-Gel belegte, dass Cadaverin bereits in einer Konzentration von 625 µM die Vernetzung von αS1-Casein fast vollständig unterdrückt. Dagegen war im Kontrollansatz ohne Inhibitor αS1-Casein vollständig polymerisiert. Für die anschließende Untersuchung der Zeitabhängigkeit der Reaktion mit 625 µM Cadaverin wurde das Substratprotein im Ansatz auf 4 µg gesenkt, sodass ein 190-facher molarer Überschuss des Inhibitors vorlag. Die Inkubation erfolgte zwischen 0 und 10 min bei 37°C, da bereits 10 min ausreichten, um αS1-Casein mit 30 mU TGase vollständig in Oligomere und hochmolekulare Polymere umzusetzen (Abb. 4.1).
Der Einbau von Cadaverin in αS1-Casein mit TGase war ebenfalls bereits nach 10 Minuten abgeschlossen. Auf dem Elektrophoresegel zeigte sich eine leichte Verschiebung sowohl der Hauptproteinbande von ca. 30 kDa als auch einer Verunreinigung bei ca. 70 kDa zu niedrigeren apparenten Molmassen. Die Quervernetzung wurde dabei weitgehend unterdrückt, wie bei den Spuren 3 – 7 am Einlauf zum Trenngel zu erkennen ist.
Abb.
Abb. Abb.
Abb. 4444....111:::: 1 Untersuchungen zur Inhibierung der Quervernetzung von Untersuchungen zur Inhibierung der Quervernetzung von αUntersuchungen zur Inhibierung der Quervernetzung von Untersuchungen zur Inhibierung der Quervernetzung von αααS1S1S1S1----Casein durch TGase mittels Casein durch TGase mittels Casein durch TGase mittels Casein durch TGase mittels Cadaverin.
Cadaverin.Cadaverin.
Cadaverin. 4 µg αS1-Casein wurden in 50 mM Tris-HCl pH 7,0 mit 0 und 625 µM Cadaverin und 30 mU TGase zwischen 0 und 10 min bei 37°C inkubiert. Silbergefärbtes 12,5%iges SDS-Polyacrylamid-Gel Spur 1: αS1-Casein; Spur 2: αS1-Casein + TGase, 10 ' Inkubation; Spur 3 – 7: αS1-Casein + TGase + 625 µM Cadaverin, 0 '; 1 '; 2 '; 5 ' und 10 ' Inkubation.