NH 2 HOOC
A. karataviense 3 giganteum 2
3.8 Steroide in Arten der Gattung Hoodia
3.8.1 Untersuchungen an einigen Extrakten aus Hoodia, Stapelia sowie verwandten Arten
Für die Vermarktung von Hoodia-Extrakten ist eine Standardisierung der Extrakte notwendig. Dazu müssen mehr Informationen über die Steroidglykoside und über deren Vorkommen in Hoodia-Arten bekannt sein. Hier sollten die Gehalte an Steroidglykosiden in verschiedenen Arten bestimmt und miteinander verglichen werden. Dies wäre zunächst der erste Schritt, da der Gehalt an Steroiden innerhalb einer Art stark schwankt. So kommt es zu Schwankungen in Abhängigkeit von den Wachstumsbedingungen, dem Standort der Pflanze und natürlich auch von der Behandlung der Pflanzen nach der Ernte, wie den Lagerungsbedingungen und der Extraktionsmethode.
Zur Untersuchung wurden die lyophilisierten Pflanzenteile unter Rückfluss für 30 Minuten mit Methanol extrahiert. Die Aufreinigung der am Rotationsverdampfer eingeengten Extrakte erfolgte über C18-SPE-Kartuschen. Zur Untersuchung der aufgereinigten Extrakte wurden HPLC-MS- und MS/MS-Messungen eingesetzt (Beschreibung der Methoden in Kapitel 2.12.1 und 2.12.2). Die Steroidglykoside in Hoodia gordonii konnten, wie in der Methode von Avula beschrieben, mittels UV Detektion bei 220 nm nachgewiesen werden.
Die wirksame Komponente P57 wurde aus Hoodia gordonii und Hoodia piliferum isoliert, daneben sind allerdings noch einige andere Hoodia Arten bekannt. Einige weitere Arten, sowie nahe verwandte Arten, wie z.B. Stapelia Arten sollten hier auf ihr
Zusätzlich sollte der Inhalt einer über das Internet bezogenen Hoodia Extrakt-Kapsel untersucht werden. Dieses, als Abnehmhilfe beworbene, Produkt soll einen Pulverextrakt von Hoodia gordonii enthalten.
3.8.1.1 MS/MS Messungen
Zum Nachweis der Steroidglykoside mit Pregnangrundgerüst erfolgte die Untersuchung der Extrakte von Hoodia gordonii mit MS/MS Messungen. Hierzu wurde zunächst ein Mutterionenscan auf das Pregnangrundgerüst (m/z 313) durchgeführt (Abb. 3.63). Mit dieser Methode können alle Moleküle, die bei der Fragmentierung ein Fragment mit dem entsprechenden Masse zu Ladungsverhältnis bilden, detektiert werden. Die Messung führte zu einer Vielzahl von Substanzen mit m/z 600 bis 1400.
Das von van Heerden [1999] beschriebene P57 war jedoch nicht nachweisbar. Daher wurden die beiden Substanzen mit dem höchsten Signal, m/z 1040 und 1024, näher betrachtet.
OH2 O
m/z 313 +
Abb. 3.63: Struktur des Pregnangrundgerüstes, das als Fragment bei MS/MS Experimenten entsteht (m/z 313)
Hierzu erfolgte zunächst die Untersuchung des Fragmentierungsmusters, um genauere Informationen zur Struktur dieser Moleküle zu erlangen. Das MS/MS Spektrum von m/z 1040 ist in Abbildung 3.64 wiedergegeben.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 m/z, amu
5000,0 1,0e4 1,5e4 2,0e4 2,5e4 3,0e4 3,5e4 4,0e4 4,5e4 5,0e4 5,5e4 6,0e4
6,4e4 610,3
313,3
295,3 273,1
457,2
761,4
145,1 1040,3
601,4 207,1 289,3
861,4 179,2
466,1 664,3
413,2 167,1 305,2 399,2
147,4 528,9
Abb. 3.64: MS/MS Spektrum von m/z 1040, das Fragmentierungsmuster deutet auf das dargestellte Pregnanglykosid hin
Aus diesem Fragmentierungsmuster kann auf das in der Abbildung 3.64 wiedergegebene Pregnanglykosid mit vier Zuckerresten geschlossen werden. Die Fragmente hierzu sind in Abbildung 3.65 und 3.66 wiedergegeben. Es handelt sich also vermutlich um Hoodigiosid D [Dall`Acqua und Innocenti 2007].
O O
O
O O O O
OH O
O O O O O
H
O O
OH OH
O
m/z 1040
O O
O O
O O O H
O
H O
O OH O
O
O O
O O
H OH O
O
O O
O H
OH OH
O O
O O
O H
OH
O O
O O
O O O O O
H OH OH
O O
O
O O O O O O O O O
H OH OH
O O
O
O O O O
OH O
O O O O O
H
O O
OH OH
O m/z 147
m/z 145 m/z 161
m/z 178 m/z 306
m/z 289
m/z 273
m/z 466 m/z 610
m/z 1040
Abb. 3.65 Mögliche Strukturen der Fragmente der MS/MS-Messungen von m/z 1040 (Teil 1)
OH O
O OH O O
O
O O
O O O
O
O O O O
OH O
O O O O O
H
O O
OH OH
O
O O O O
OH O
O O O O
O O
OH
O O
O O O
OH O
O O O
O OH
O
O O O O
OH O
O
O O
O O
OH O
m/z 313
m/z 295 m/z 413
m/z 395
m/z 1040
m/z 861 m/z 761
m/z 601 m/z 457
Abb. 3.66: Mögliche Strukturen der Fragmente der MS/MS-Messungen von m/z 1040 (Teil 2)
Des weiteren wurde die Substanz mit m/z 1024 näher untersucht. Auch hier wurden zunächst MS/MS Messungen durchgeführt. Das Fragmentierungsmuster von m/z 1024 ist in Abbildung 3.67 wiedergegeben und deutet auf ein Pregnanglykosid mit vier Zuckerresten hin (Abb. 3.68).
+EPI (1024,90) CE (10): 43 MCA scans from Sample 8 (LC 8,MeOH,EPI 1024.9 CAD high) of 06.03.09.wiff (Turbo Spray) Max. 2,5e4 cps.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200
m/z, amu 2000,0
4000,0 6000,0 8000,0 1,0e4 1,2e4 1,4e4 1,6e4 1,8e4 2,0e4 2,2e4 2,4e4
2,5e4 313,3
1024,4 543,3
594,2
145,1
306,2 450,1
289,2
457,4 207,2
191,2 239,1 601,3
425,2 413,2
179,2195,2 525,4 558,2 990,2
407,2
Abb. 3.67: MS/MS Spektrum von m/z 1024, das Fragmentierungsmuster deutete auf ein Pregnanglykosid mit vier Zuckerresten hin
Ein Vergleich mit m/z 1040 läßt auf große strukturelle Ähnlichkeiten schließen. Eine Gegenüberstellung der Schlüsselfragmente von m/z 1040 und m/z 1024 ist in Tabelle 3.15 wiedergegeben.
O O
OH O O
O O
O
m/z Fragment m/z 1040 m/z Fragment m/z 1024
313
OH O
313
OH O
466
O O
O O
O O O O O
H OH OH 450
O O
O O
O O O O O
H
OH
610 O
O O
O O O O O O O O O
H OH OH 594 O
O O
O O O O O O O O O
H
OH
761 O
O O O
OH O
O O O
O OH
O
745 O
O O O
OH O
O O O O
O
Tab. 3.15: Vergleich der Schlüsselfragmente von m/z 1040 und m/z 1024
Ein Vergleich der Fragmente ergibt, dass der dritte Zucker in der Kette reduziert vorliegt. Das Pregnanglykosid enthält demnach Cymaropyranose, anstelle der Thevetopyranose in Hoodigioside D. Demnach handelt es sich um Hoodigioside C [Dall`Acqua und Innocenti 2007].
3.8.1.2 HPLC-MS Messungen der Extrakte
Zusätzlich wurden die Extrakte mittels HPLC-MS untersucht, um einen Überblick über die enthaltenen Steroide zu erhalten und die Arten untereinander zu vergleichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.16 zusammengefasst. Die Identifizierung erfolgte hierbei nur über einen Abgleich der Molekulargewichte mit den nachgewiesenen Masse zu Ladungsverhältnissen. Die Daten geben daher nur Hinweise auf die vorhandenen Steroide, können deren Vorkommen aber nicht beweisen. Hierzu wäre ein Abgleich mit Standardsubstanzen oder eine Isolierung und Strukturaufklärung nötig. Die Strukturen der angegebenen Steroidglykoside sind in Tabelle 1.1 zusammengefasst.
Wie Tabelle 3.16 zu entnehmen ist, konnten einige der beschriebenen Steroidglykoside in Hoodia und in verwandten Arten detektiert werden. Zur Vereinfachung wurden in Tabelle 3.16 jeweils nur ein Substanzname angegeben. Dabei sind allerdings mehrere Substanzen mit demselben Molekulargewicht denkbar. Eine Unterscheidung war mit der verwendeten HPLC-MS Methode nicht möglich. Auffällig ist, dass bei einigen Substanzen unterschiedliche Retentionszeiten in den einzelnen Spezies auftraten.
Dies war mit den verschiedenen Strukturen zu erklären. So können Steroide mit unterschiedlichen Zuckerresten auftreten, die sich nicht in ihrem Molekulargewicht unterscheiden. Beispiele hierfür sind Gordonosid E, F und G. Auch bei Steroiden, für deren Molekulargewicht nur eine Struktur bekannt ist, wie Hoodigiosid K, L, N, O und P ist dies möglich. Es könnten in der Literatur noch nicht beschriebene Steroidglykoside enthalten sein. Auch hier kann es sich um Variationen der Zuckerreste zu den bekannten Substanzen handeln.
Die in den Hoodia-Arten am häufigsten vorkommenden Steroide sind Hoodigiosid C, M, N, O und Gordonosid E. In den anderen Arten sind hauptsächlich Hoodigiosid B, D, K und O enthalten. Die Kapsel enthält Hoodigiosid A, C, D, E, K, L und O. P57 ist neben Hoodia gordonii 1 und 2 auch in Hoodia ruschii und Hoodia juttae sowie in Stapelia grandiflora und Stapelia gigantea enthalten.
Auch hier sind die Ergebnisse nicht eindeutig. Um die Strukturen der nachgewiesenen Substanzen zu verifizieren, müssten weitere MS/MS Experimente und eine weitere Aufreinigung der Extrakte durchgeführt werden.
Hoodia currorii 33,7 min 31,5 min / / / / / / / 33,3 min / / / / 25,3 min 32,4 min /
Hoodia flavum / / / / / / 32 min / / 33,3 min 34,6 min / / / 33,0 min / /
Hoodia juttae 33,7 min / 32,2 min / / / / 31,6 min 30,8 min 33,3 min / / / 28,0 min 33,0 min 32,4 min 34,0 min
Hoodia ruschii / / 32,2 min 32,2 min 33,9 min / / 31,6 min / 33,3 min / 28,3 min 32,7 min 28,0 min / 32,4 min /
Hoodia bradei / / 32,2 min / / 33,8 min / / 30,8 min 33,3 min 34,6 min / / 28,0 min / 32,4 min /
Hoodia pilifera / / / / / / / / / / / / / 28,0 min 33,0 min / /
Hoodia gordonii 3 / / 32,2 min / / 27,4 min 32 min / / 33,3 min / / / 28,0 min / / 34,0 min
Hoodia gordonii 2 33,7 min / 32,2 min 32,2 min 30,4 min / 32 min 31,6 min / 33,3 min 34,6 min 28,3 min / 28,0 min / 32,4 min /
Hoodia gordonii 1 33,7 min / / / 30,4 min / / 31,6 min / 33,3 min / / / / 33,0 min 32,4 min /
Hoodigiosid A Hoodigiosid B Hoodigiosid C Hoodigiosid D Hoodigiosid E Hoodigiosid F Hoodigiosid K P57 Gordonosid D Gordonosid E Gordonosid L Hoodigiosid L Hoodigiosid V Hoodigiosid M Hoodigiosid N Hoodigiosid O Hoodigiosid P
Kapsel 33,7 min / 32,2 min 32,2 min 33,9 min / 26,5 min / / / / 31,7 min / / / 32,4 min /
Orbea decaisneana / / / 32,2 min / / 26,5 min / / / / / / / / 32,4 min /
Tromotriche revoluta / 31,5 min / / / / / / / / / / 32,7 min / / / /
Quaqua mamilaris / 31,5 min / / / / / / / 33,3 min / / / / 25,3 min 32,4 min /
Stapelia leendertziae 33,7 min 31,5 min / 32,2 min / / 32 min / 30,8 min / / / / / / / /
Stapelia gigantea / 31,5 min 32,2 min 32,2 min / / 32 min 31,6 min / / / / / / 30,4 min 32,4 min 27,2 min
Stapelia grandiflora / 31,5 min / / / / 32 min 31,6 min / / / / / / / / /
Hoodigiosid A Hoodigiosid B Hoodigiosid C Hoodigiosid D Hoodigiosid E Hoodigiosid F Hoodigiosid K P57 Gordonosid D Gordonosid E Gordonosid L Hoodigiosid L Hoodigiosid V Hoodigiosid M Hoodigiosid N Hoodigiosid O Hoodigiosid P
Tab. 3.16: Zusammenfassung der Ergebnisse der HPLC-MS Messungen (Hoodigiosid C: