Proteinfraktion A

3.3.2.1 Enzymaufreinigung: Affinitätschromatographie über eine Con A Säule

Die weitere Aufreinigung konnte mit einer Affinitätschromatographie erreicht werden.

Die in Kapitel 3.2.1.2 beschriebenen Ergebnisse der Proteingelbestimmungen ließen auf größere Mengen Glykoprotein in der Probe schließen. Aus diesem Grund sollte zunächst eine Methode zur Abtrennung von Glykoproteinen getestet werden. Hierzu wurde eine Säule mit an Agarose immobilisiertem Concanavalin A (Con A) verwendet.

Con A bindet mit hoher Affinität spezifisch an α-D-Mannose- und α-D-Glucose-haltige Kohlenhydrate, aber auch mit geringerer Affinität an andere Zucker [Kanellopoulos et al. 1996]. Die Bindung an Mannose ist hierbei stärker als an Glukose, an oligo- und polymere Kohlenhydrate stärker als an Monomere. Hier erfolgt die Bindung bevorzugt an den Kettenenden [Goldstein et al. 1965]. Zur Elution des reversibel gebundenen Enzyms wurde eine 0,4 M Methyl-α-D-Mannosepyranosid-Lösung verwendet (eine Beschreibung der Methode findet sich in Kapitel 2.7.2). Die Affinität des Con A zu Mannose war hoch und wurde durch die eingefügte Methylgruppe noch gesteigert. Die Mannose-Lösung verdrängte das Glykoenzym aus der Bindung. Niedrigere Konzentrationen konnten das Enzym nicht aus der Con A Bindung verdrängen. Zum Vergleich kann die Alliinase, ein Glykoprotein mit mehreren Mannose-Resten in der Seitenkette [Nock und Mazelis 1986], bei der Aufreinigung über eine Con A Säule mit Konzentrationen zwischen 5 und 25 mM Methyl-α-D-Mannosepyranosid eluiert werden. Die Bindung des gesuchten Enzyms an Con A war also sehr viel stärker als die der Alliinase. Dies könnte bedeuten, dass in der Glykoseitenkette mehr Mannose-Reste enthalten waren als in der Seitenkette der Alliinase. Eine weitere Möglichkeit wäre eine für die Bindung an Con A günstigere Anordnung der Zuckerreste.

Alliinasen aus Allium-Arten sind Glykoproteine, wie z.B. die sehr gut untersuchte Alliinase aus Knoblauch. Da diese wie das gesuchte Enzym ebenfalls an Con A band, konnten die beiden Proteine mit dieser Methode nicht voneinander getrennt werden.

Daher wurde vor der Elution zunächst mit einer 0,2 M Methylmannoselösung gespült.

Hiermit eluierte eventuell gebundene Alliinase, während das gesuchte Enzym unter diesen Bedingungen auf der Säule verblieb. Die Elution des Proteins erfolgte im Anschluss mit einer 0,4 M Methylmannoselösung. Die aktiven Fraktionen wurden konzentriert und bei 4°C gelagert.

Das Ergebnis der Aufreinigung wurde mittels SDS-PAGE Gelen überprüft. Die Anfärbung erfolgte mittels Coomassie Blue oder Silberfärbung. Wie in Abbildung 3.11 abzulesen, sind nach der Gelchromatographie (Superose12) deutlich mehrere Banden zu erkennen (Reihe 2). Verglichen mit dem Rohproteinextrakt (Reihe 3) konnte hingegen bereits eine deutliche Aufreinigung erreicht werden. Die intensivste Bande hat ein Molekulargewicht von ca. 30 kDa. Diese gehört zu den beiden intensiven Banden zwischen 23 und 32 kDa. Die kleinere der beiden Banden wird nach der Gelchromatographie schwächer. Im höhermolekularen Bereich sind noch drei weitere Banden zu erkennen (ca. 40 kDa, 55 kDa und 90 kDa). Die 55 kDa Bande ist vermutlich der Alliinase zuzuordnen.

Nach der Affinitätschromatographie ist nur noch eine Bande im silbergefärbten Gel zu Abb. 3.11: Reihe 1: aufgereinigtes Enzym von A. giganteum, Reihe 2: Rohextrakt von A. macleanii, Reihe 3: Extrakt von A. macleanii nach Gelchromatographie, Reihe 4: aufgereinigtes Enzym von A. macleanii (Silberfärbung)

Zur Vereinfachung wird das Protein, welches über die Con A Säule aufgereinigt wurde, im folgenden Proteinfraktion A genannt.

3.3.2.2 Enzymaufreinigung: Eigenschaften des Proteinfraktion A

Ein Vergleich der Retentionszeit des Enzyms mit der Retentionszeit von Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht in der Gelchromatographie zeigte, dass das native Protein ein Molekulargewicht von ca. 100 – 120 kDa aufwies. Es handelt sich also um ein Homotrimer oder wahrscheinlicher um ein Homotetramer. Da eine Aufreinigung mit einer Con A-Säule möglich war, enthielt das Enzym vermutlich eine Glyko-Seitenkette mit Mannose oder Glucose. Die hohe Affinität des Enzyms zum Con A ließ auf einen hohen Mannoseanteil schließen.

Das Eluat reagierte mit einem niedermolekularen, enzyminaktivierten Extrakt von A.

macleanii zu einem roten Produkt. Es zeigte aber auch eine Polyphenoloxidase-Aktivität und oxidierte Brenzcatechinlösungen zu braunen Oxidationsprodukten. Es wurde von Pyridoxal-5´-phosphat und NaCl stabilisiert und von Aminooxy-Essigsäure, einem Alliinaseinhibitor, inhibiert. Es handelt sich also vermutlich um ein Glykoprotein mit einer Alliinase-ähnlichen Aktivität.

Mit einer Probe des aufgereinigten Enzyms aus A. macleanii wurde eine Sequenzierung durchgeführt (Seqlab, Göttingen). Die N-terminale Sequenzierung ergab die in Tabelle 3.3 wiedergegebene Aminosäuresequenz:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

A D T I V A V E L D T Y P Tab. 3.3: N-terminale Aminosäuresequenz von Proteinfraktion A (Bestimmung durchgeführt von Seqlab AG, Göttingen)

Eine Datenbankrecherche (UniProt Knowledgebase (Swiss-Prot + TrEMBL)) zeigte eine 100%ige Sequenzübereinstimmung mit dem Lektin Con A aus Canavalia ensiformis. Das an das Säulenmaterial immobilisierte Con A war also vermutlich in die Probe gelangt.

Zur Überprüfung wurde eine neu gepackte Säule in einem Blindlauf zunächst mit Phosphatpuffer, dann mit der verwendeten Mannoselösung gespült (Abb. 3.12). Das Eluat wurde fraktioniert aufgefangen, aufkonzentriert und mittels Gelelektrophorese untersucht. Die ersten 100 ml des Phosphatpuffers enthielten ungebundenes Lektin, spätere Fraktionen nicht mehr. Da neue Säulen vor der Verwendung immer mit 150 bis 200 ml Puffer vorgespült wurden, sollte dies keine Verunreinigungsquelle sein. Danach konnten mit dem Mannosepuffer signifikante Mengen Con A von der Säule gelöst werden. Die Gesamtmenge des Mannosepuffers betrug 150 ml. Noch in der letzten Fraktion konnte Con A nachgewiesen werden.

Die vom Hersteller (Sigma) empfohlene Methylmannosekonzentration zur Elution beträgt 5 bis 500 mM. Die verwendete Methyl-Mannoselösung (0,4 M) befand sich also innerhalb der Spezifikation. Unter diesen Bedingungen sollte keine Ablösung des Säulenmaterials auftreten. Der Grund hierfür konnte nicht abschließend geklärt werden. Möglicherweise war die Konzentration so hoch, dass das Säulenmaterial von der Bindung an das Lektin durch die Mannose verdrängt wurde. Weiterhin möglich ist eine so feste Bindung des Con A an das Enzym, das eine Ablösung des Enzyms nur durch eine Abtrennung des Con A von dem Säulenmaterial erreicht werden konnte.

Durch die Zusammensetzung des Puffers könnte es aber auch zu einer Zerstörung der Con A-Proteinstruktur und damit zu einem Ablösen einzelner Untereinheiten

Abb. 3.12: Überprüfung der Ablösung von Con A von einer neuen Säule; Reihe 1:

Phosphatpuffer Fraktion 2, Reihe 2: Phosphat-puffer Fraktion 4, Reihe 3: PhosphatPhosphat-puffer Fraktion 5, Reihe 4: Methylmannosepuffer Fraktion 1; Reihe 5: Methylmannosepuffer Fraktion 2

Verhalten. Das Sepharose-Derivat schien stabiler; mit der Methylmannoselösung wurde weniger Con A eluiert. Die Stabilität war aber nicht ausreichend, um den Eintrag von Con A in die Probe zu verhindern.

Sowohl das von der Säule gelöste als auch reines Con A zeigten keine enzymatische Aktivität. Da die zur Sequenzierung verwendete Probe Enzymaktivität aufwies, muss in der Lösung auch das gesuchte Enzym enthalten gewesen sein. Bei der Sequenzierung konnte diese offensichtlich geringe Menge hingegen nicht erfasst werden. Ein weiteres Konzentrieren der Probe führte zu zusätzlichen, höhermolekularen Banden neben der 30 kDa Bande im SDS Gel. Zwei der Banden konnten mittels MALDI-TOF-MS/MS eindeutig von Con A abgegrenzt werden. Eine weitere Einordnung oder Sequenzierung dieser Banden war nicht möglich.

Eine Abtrennung des Lektins von dem gesuchten Enzym war aufgrund der ähnlichen Eigenschaften der Substanzen problematisch. Beide Proteine haben ein ähnliches Molekulargewicht, gleich große Untereinheiten und ähnliche Affinitätseigenschaften.