3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
3.4 Untersuchung von N-Cadherin, als ein Zielgen der E-Cadherin Signalkette
Nachdem eine Signalkette ausgehend von E-Cadherin ermittelt werden konnte, suchten wir zusätzlich neben IL-8 nach einem weiteren Zielmolekül in dieser Signalkaskade. Diese Daten sind bereits zur Veröffentlichung eingereicht und befinden sich im Anhang III dieser Dissertation.
Der Switch der Cadherin Klasse von E-Cadherin zu N-Cadherin während der Entstehung des Melanoms ist bereits beschrieben worden. Dieser Vorgang ist nicht nur aus der Krebsentstehung bekannt, sondern läuft auch während der Embryogenese ab.
Klassisch wird das Annehmen der mesenchymalen Eigenschaft von Zellen und der Verlust der epithelialen Morphologie als EMT (epitheliale-mesenchymale Transition)
NHEM Melanom
bezeichnet. Ob sich der Wechsel der Cadherin Expression eventuell direkt beeinflussen kann, wurde von uns als nächstes analysiert. Es interessierte uns, ob der Verlust der E-Cadherin Expression im Melanom direkt mit der N-Cadherin Expression korrelierte. Und, ob E-Cadherin die N-Cadherin Expression regulieren kann.
Dem Molekül Twist wurde bisher eine Rolle bei der N-Cadherin Regulation zugewiesen. Twist ist während der Gastrulationsphase in der Entwicklung von Drosophila melanogaster für die Aktivierung der N-Cadherin Expression verantwortlich (Oda et al., 1998). Außerdem wird Twist eine Aufgabe während des Wechsels der Cadherin Klasse von E-Cadherin zu N-Cadherin bei der epithelialen-mesenchymalen Transition in Drosophila melanogaster und auch weiterer Organismen wie C. elegans, G. gallus oder M. musculus usw. zugewiesen (Castanon und Baylies, 2002). Wir spekulierten, dass E-Cadherin ein Repressor von Twist ist. Außerdem vermuteten wir, dass nach dem Verlust von E-Cadherin die N-Cadherin Expression durch Twist stimuliert wird. Unsere Daten, die nicht publiziert sind, zeigten jedoch keine Beteiligung von Twist an der N-Cadherin Regulation, während der Entstehung vom malignen Melanom. Wir konnten zwar zeigen, dass Twist in unseren Melanomzelllinien, im Vergleich zu Melanozyten, exprimiert wurde und dieses Expressionsmuster mit der N-Cadherin Expression übereinstimmte. Die Regulation von Twist durch E-N-Cadherin konnte in unseren Zellen aber bisher nicht gefunden werden. Melanomzellen unserer Modellsysteme, mit E-Cadherin Reexpression, zeigten ebenfalls eine Twist Expression.
Dieses würde bedeuten, dass in diesen Modellzellen neben E-Cadherin auch die N-Cadherin Expression hochreguliert ist, was nicht der Fall war. Es erfolgte also die Suche nach einem weiteren Modulator des Cadherin Klassen Switches. Es sollte geklärt werden, ob NFkappaB eventuell die N-Cadherin Expession regulierte.
Die Beteiligung von NFkappaB zur Vermeidung von Apoptose bei der Entstehung von Krebs ist vielfach erwähnt worden. Auch das Mitwirken von NFkappaB an der Progression vom malignen Melanom wurde beschrieben. Aber die Teilnahme von NFkappaB an Prozessen der epithelialen-mesenchymalen Transition ist eine relativ neue Erkenntnis (Huber et al., 2004). Wirth et al., konnten am Mammakarzinom zeigen, dass die Inhibierung von NFkappaB die EMT verhinderte. Daher vermuteten wir, dass der Verlust von E-Cadherin und die Expression von N-Cadherin im malignen Melanom im engen Zusammenhang stehen könnten und dieses durch NFkappaB reguliert wird.
Die Reexpression von E-Cadherin in den Melanom Modellsystemen führte tatsächlich dazu, dass die endogene N-Cadherin Expression unterbunden wurde. Sowohl die transiente Expression von E-Cadherin, als auch die Expression von E-Cadherin in den stabilen asSNAIL Zellklonen führten zu einer verminderten endogenen N-Cadherin
Expression, im Vergleich zu der Ursprungszelllinie Mel Im (Kuphal und Bosserhoff, 2005 zur Veröffentlichung eingereicht, im Anhang III, Seite 5 und Abbildung 4).
Analysen des N-Cadherin Promotors durch Luciferase Aktivitätsassays zeigten auch eine verminderte N-Cadherin Promotor Aktivität in E-Cadherin exprimierenden Zellen (Kuphal und Bosserhoff, 2005 zur Veröffentlichung eingereicht, Anhang III, Seite 5).
Auch der zytoplasmatische Teil von E-Cadherin hatte einen Einfluß auf die endogene N-Cadherin Expression in den Melanomzellen. Die in Kapitel 3.1 beschriebenen Mel Im Zellklone E-Cadherin CDc, CDd, CDe und E-Cadherin M2, M3, M7 wiesen nach ihrer zytoplasmatischen E-Cadherin Expression verminderte Proteinmengen des Zelladhäsionmoleküls N-Cadherin auf (Abbildung 19). Quantitative Echtzeit PCR mit Primern für N-Cadherin und Western Blots mit einem Antikörper gegen N-Cadherin, zeigten verminderte RNA- und Proteinmengen in den generierten Zellklonen im Vergleich zu der Ursprungszelllinie Mel Im, die eine hohe N-Cadherin Expression aufwies (Kuphal und Bosserhoff, 2005 zur Veröffentlichung eingereicht, Anhang III).
Abbildung 19: Western Blot mit anti-N-Cadherin Antikörper, der eine verminderte N-Cadherin Proteinmenge in den Zellklonen zeigt, die zytoplasmatisches E-Cadherin exprimieren. Die Ursprungszelllinie Mel Im exprimiert viel N-Cadherin. E-CadherinM=membrane bound cytoplasmic E-Cadherin; E-Cadherin CD=soluble cytoplasmic E-Cadherin. Beta-Aktin dient der Ladekontrolle (Kuphal und Bosserhoff, 2005, zur Veröffentlichung eingereicht).
Für diese Zellklone wurde in Luciferase Reportergenassays auch eine verminderte N-Cadherin Promotor Aktivität gemessen (Kuphal und Bosserhoff, 2005 zur Veröffentlichung eingereicht, Anhang III, Seite 5, Abbildung 4D).
Das NFkappaB die N-Cadherin Expression regulierte, haben wir durch Luciferase Aktivitätsassays zeigen können. In diesen Assays wurde allerdings der Promotor des G. gallus untersucht. Der klonierte Promotor wurde uns freundlicherweise von der
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Goltzmann zur Verfügung gestellt. Der humane und der G.
Gallus N-Cadherin Promotor haben eine Homologie von 40% (Alignment der Sequenzen mit dem Programm DNAMAN). Nach der Transfektion der Untereinheiten p50 und p65 (NFkappaB) in die Melanomzelllinien Mel Im und Mel Ei und den Kolonzelllinien SW480 und CaCo-2, konnte der N-Cadherin Promotor in Luciferase Assays aktiviert werden. Die Analyse der Kolonzelllinien zeigte, dass es sich bei N-Cadherin Regulation um ein Zelltyp unabhängiges Ereignis handelte.
Die adenovirale Transduktion eines rekombinanten, replikationsdefizienten Vektors (Ad5IkappaB), der zur Expression eines nicht-degradierbaren IkappaB im Zytoplasma führte, und die Untereinheiten p50 und p65 von NFkappaB im Zytoplasma zurück halten kann, führte im Vergleich zu Kontrolltransduktionen (Ad5LacZ) zu einer Inhibition der N-Cadherin Expression. Als Kontrolle für eine erfolgreiche Transduktion wurde die Expression des NFkappaB Zielgens IL-8 und des NFkappaB unabhängigen Gens MMP-1 in quantitativer Echtzeit PCR überprüft. Nach Inhibierung der NFkappaB Aktivität kam es zur direkten Unterdrückung der IL-8 und N-Cadherin Expression sowohl nach 24, als auch 48 Stunden. Zusätzlich wurde der Inhibitor MG-132 angewandt, der die Degradation von Ubiquitin konjugierten Proteinen inhibierte. Das bedeutet, das nach Inkubation der Zellen mit MG-132 auch die Degradation von IkappaB nicht mehr stattfand und stabilisiertes IkappaB in der Lage war, p50 und p65 im Zytoplasma zurück zu halten. Nach der Verminderung der NFkappaB Aktivität für 4 und 8 Stunden, kam es zu einer verminderten N-Cadherin Expression. Daraus schlossen wir, dass E-Cadherin zunächst die NFkappaB Aktivität verminderte, wie es in Abbildung 18 dargestellt ist. Anschließend wird durch die verminderte transkriptionelle Aktivität von NFkappaB die N-Cadherin Expression unterbunden.
Umgekehrt führte die Initiierung der NFkappaB Aktivität mit Hilfe von LPS (Lipopolysaccharid) und TNF-alpha in NHEM zu einer Induktion der N-Cadherin Expression, wie quantitative Echtzeit PCR`s bestätigten. Melanomzellen, die keine E-Cadherin Expression aufweisen, haben somit eine erhöhte NFkappaB Aktivität, die die Expression von N-Cadherin fördert (Kuphal und Bosserhoff, 2005 zur Veröffentlichung eingereicht, Anhang III, Seite 5-6).
Um nun festzustellen, ob der Signalweg von E-Cadherin, der die NFkappaB Aktivität drosselte, auf die Expression von N-Cadherin einwirkt, haben wir zunächst mögliche NFkappaB Bindungsstellen im humanen und G. gallus N-Cadherin Promotor gesucht.
Die Suchmaschiene Genomatix/MatInspector (www.genomatix.de) fand eine mögliche NFkappaB Bindungsstelle im humanen N-Cadherin Promotor mit der Konsensussequenz: 5`-GGGGAGCGCC-3´ und im Huhn N-Cadherin Promotor wurden die NFkappaB Bindungsstellen 5`-GGGCACGATCC--3´ und 5´-GGGCTGGGGCC-3´
ermittelt. EMSA Experimente zeigten, dass NFkappaB Untereinheiten aus Kernextrakten von Melanomzellen tatsächlich an die ermittelten Konsensussequenzen im N-Cadherin Promotorbereiche binden konnten. Das war der direkte Beweis für eine NFkappaB Regulation des endogenen N-Cadherin Promotors und auch der Regulation des N-Cadherin Promotors durch E-Cadherin Reexpression in Melanomzellen (Kuphal und Bosserhoff, 2005 zur Veröffentlichung eingereicht, Anhang III).
Die Abbildung 18 läßt sich also folgendermaßen erweitern: durch den Verlust der E-Cadherin Expression im Melanom wird die Aktivität von der MAP Kinase p38 gesteigert, die wiederum die transkriptionelle Aktivität von NFkappaB anregt. Dadurch kommt es zu einer vermehrten Expression von endogenem N-Cadherin und dem sogenannten Cadherin Switch. Dadurch exprimieren Melanomzellen N-Cadherin und erlangen veränderte Adhäsionseigenschaften, die sie in Kontakt zu Fibroblasten und Endothelzellen in der Dermis treten lassen.
4 Ausblick
Fortführende Arbeiten sollen den komplizierten Mechanismus der E-Cadherin Signalkaskade weiter aufklären. Bislang fehlt die Charakterisierung weiterer Moleküle, die im Zytoplasma vermittelnde Eigenschaften für die Weitergabe der Phosphorylierung von p38 auf NFkappaB übernehmen. Auch die Signalübermittlung durch zytoplasmatisches beta-Catenin ist bisher ungeklärt.
Desweiteren fehlt die Klärung der Regulation der neuen Zielgene von Snail. Die E-Cadherin Repression im Melanom ist bekannt, wie Snail aber die Aktivität der neuen Zielgene steigert, ist noch nicht bekannt. Entweder bindet Snail an den Promotor der Gene und wirkt im Fall von MMP-2, EMMPRIN, TIMP-1, SPARC, Notch4, RhoA und t-PA als Aktivator oder Snail benötigt weitere vermittelnde Moleküle für seine transkriptionelle Aktivität. Zuerst könnte durch computergestütze Analysen eine Promotorcharakterisierung der sieben Gene erfolgen, indem nach Bindungstellen für Snail gesucht wird. Auch der Einfluss von MIA auf die E-Cadherin Expression bleibt noch weiter zu untersuchen. Es ist noch nicht bekannt, wie MIA E-Cadherin reprimiert.
Eventuell findet diese Regulation durch Snail statt.
Generell bleiben bezüglich der Entstehung des malignen Melanos noch viele Fragen offen. Auch der völlig veränderte Wnt/beta-Catenin/LEF/TCF Signalweg, der zur Ansammlung von beta-Catenin im Zytoplasma und nicht im Kern führt, ist ein sehr interessantes zu untersuchendes Phänomen.