Durch E-Cadherin regulierte zytoplasmatische Moleküle

Die vermittelnden Moleküle zwischen E-Cadherin als Signalmolekül und NFkappaB im Zellkern sind für das maligne Melanom bisher noch nicht beschrieben. Allerdings sind die MAP Kinasen als zytoplasmatische Signalvermittler bekannt (Pece und Gutkind, 2000). Daher untersuchten wir als erstes die MAP Kinasen als Signalüberträger zwischen E-Cadherin und NFkappaB. Wir analysierten dabei die Phosphorylierung von vier verschiedenen MAP Kinasen im Melanom. Zu der Familie der MAP Kinasen gehören c-jun NH2-terminale Kinase (JNK), p42/p44 ERK1/2 und p38 (siehe Abblidung 14). Der Status der genannten Kinasen wurde zwischen Melanomzellen (E-Cadherin

negativ) und E-Cadherin reexprimierenden Melanomzellen, verglichen. Die Daten über die MAP Kinasen sind von uns bereits publiziert worden und befinden sich gemeinsam mit den Daten über die NFkappaB Aktivität im Anhang I der Dissertation.

Die Beteiligung der MAP Kinasen ERK1 und ERK2 an Regulationsprozessen zur Entwicklung des malignen Melanoms wurde bereits beschrieben. Allerdings bezog sich diese MAP Kinase Aktivität bisher auf die maligne Transformation von Melanozyten zu Melanomzellen (Govindarajan et al., 2003). Dhawan et. al., zeigten im Melanom eine erhöhte Aktivität des Signalweges NIK/MEK1/2/ERK1/2 durch Zytokine (Dhawan und Richmond, 2002). Die MAP Kinasen p42/p44 (ERK1 und ERK2) sind auch in unseren Melanomzelllinien konstitutiv phosphoryliert. Es lassen sich aber keine Aktivitätsunterschiede von ERK in Melanomzellen, die E-Cadherin nicht exprimieren und in Zellen, die E-Cadherin reexprimieren, erkennen (Kuphal et al., 2004, im Anhang, Seite 8514). Die Beteiligung der ERK MAP Kinasen an der E-Cadherin Signalweiterleitung wurde damit ausgeschlossen.

Auch die Beteiligung der Kinase JNK (c-jun NH₂-terminal kinase), und der in dieser Signalkaskade folgenden Kinase c-jun (Abbildung 16) an der Vermittlung von E-Cadherin Signalen, ließ sich ausschließen (Kuphal et al., 2004, Anhang I, Seite 8514).

Western Blots zeigten keine Aktivitätsunterschiede von c-jun in den in den Modellsystemen eingesetzten Zellen.

Eine weitere Publikation wies in anderen Zusammenhängen auf eine erhöhte Aktivität der MAP Kinase p38 in der Melanomzelllinie MeWo hin. Die Ergebnisse verwiesen auf einen Zusammenhang zwischen p38 Aktivität und MMP-2 Expression (Denkert et al., 2002). Desweiteren zeigten Publikationen, dass durch MGSA/GRO (melanoma growth stimulatory acitvity/growth–regulated protein) die Ras/MEKK1/MEK3/6 und anschließend p38 MAP Kinase Aktivität erhöht wird. Hier war allerdings MGSA/GRO das initiierende Protein der Signalkaskade (Wang und Richmond, 2001). Für die Aktivität der MAP Kinase p38 zeigte sich auch in unseren Experimenten eine Regulation in Abhängigkeit von der E-Cadherin Expression. Ein ELISA für die phosphorylierte MAP Kinase p38 (Abbildung 15) und Western Blots zeigten, dass die Aktivität in der Melanomzelllinie Mel Im im Vergleich zu den Zellklonen asSNAIL 4 und 5 und E-Cadherin transfizierten Mel Im Zellen erhöht war (Kuphal et al., 2004, Anhang I, Seite 8514). Es ergaben sich erste Hinweise, dass die Reexpression von E-Cadherin in Melanomzellen die Phosphorylierung von p38 verhindern konnte und Melanomzellen eine erhöhte p38 Aktivität aufwiesen.

Mel Im mock asSNAIL4 asSNAIL5 0.2µg E-Cadherin 0.5µg E-Cadherin 0

2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

p38 Aktivität (Mel Im Kontrolle entspricht 100%)

Abbildung 15: ELISA zu der Detektion der phosphorylierten Form von der MAP kinase p38.

Mel Im (100%) zeigt eine erhöhte p38 Aktivität im Vergleich zu den E-Cadherin exprimierenden Zellen (Kuphal et al., 2004).

Zudem wurde die Phosphorylierung der Proteinkinase AKT überprüft, deren Aktivität im malignen Melanom und weiterer Zelllinien (CaCo, Kolonkarzinomzelllinie; MDCK, Madin-Darby Canine Kidney) bereits häufiger von anderen Arbeitsgruppen erwähnt wurde (Dhawan und Richmond, 2002; Laprise et al., 2002; Li et al., 2003a; Pece et al., 1999). Es wurde ein Zusammenhang zwischen adhärenten Junktionen und der Aktivität des PI3K/AKT-Signalweges (siehe Abbildung 16) gesehen, daher wurde im Rahmen unserer Untersuchungen der E-Cadherin abhängigen Zelladhäsion die Phosphorylierung der AKT Kinase ebenfalls überprüft. Im Western Blot wurden keine Phosphorylierungsunterschiede der Proteinkinase AKT in Mel Im Zellen und in den Zellen der zwei E-Cadherin-Modellsysteme gefunden (Kuphal et al., 2004, im Anhang I, Seite 8514).

Abbildung 16: Schematische Darstellung der MAP Kinase Signalwege und des Akt Kinase Signalweges. Weitere überschneidende Verknüpfungen zwischen den MAP Kinasen wurden aufs Gründen dervÜbersichtlichkeit nicht berücksichtigt. Auch viele Zielmoleküle und der jeweilige Stimulus fehlen. Aufgezeichnet sind die fünf MAP Kinasen und Moleküle oberhalb und unterhalb der jeweiligen Signalkaskade. p90RSK, 90kDa ribosomale Protein S6 Kinase; Src, onkogenetische Tyrosinkinase; MEF2, myocyte enhancer factor; TRAF6, tumor necrosis factor receptor-associated factor 6; TAK1, transforming growth factor-beta-activated protein kinase 1;

MSK1, mitogen- and stress activated protein kinase 1. Verändert nach Johnson und Lapadat, 2002.

Um im Folgenden zu untersuchen, ob die p38 Phosphorylierung auch Einfluß auf die NFkappaB Aktivität besitzt, benutzten wir Inhibitoren der MAP Kinase p38. Die Inhibitoren verhindern spezifisch die Phosphorylierung von p38. Zunächst wurden durch Western Blots die Spezifität von den Inhibitoren SB203580 2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)1H-imidazole) und SB202190 (4-(4-fluorophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)1H-imidazole), für die von uns eingesetzten Konzentrationen getestet. Die Inhibitoren zeigten mit den eingesetzten Konzentrationen von 10µM und 20µM keine Wirksamkeit auf ERK1/2. Im Western Blot konnte aber gezeigt werden, dass diese Konzentrationen die Phosphorylierung von p38 spezifisch hemmten. Nachdem in der Signalkaskade die Aktivität von p38 durch die SB Inhibitoren gehemmt wurde, war auch die NFkappaB Aktivität reduziert. Das zeigten Luciferase-Aktivitätsassays (Kuphal et al., 2004, Anhang I, Seite 8515). Auch das Protein IkappaB alpha, welches für die transkriptionelle Aktivität von NFkappaB degradiert, wurde nach Inhibitorenbehandlung mit SB203580 und SB202190 im Western Blot untersucht. Wurde die Phosphorylierung von p38 unterbunden,

Cadherin exprimierenden Zellen an. Mel Im Zellen ohne E-Cadherin Expression besaßen wenig IkappaB alpha im Zytoplasma, was auf aktiviertes NFkappaB hinwies.

Bereits erschienene Publikationen deuteten auf eine erhöhte ERK MAP Kinaseaktivität in Melanomzellen hin, die die NFkappaB Aktivität steigerte (Dhawan und Richmond, 2002). Es sollte also mit unseren Experimenten überprüft werden, ob ERK1 oder ERK2 an der Regulation der NFkappaB Aktivität durch E-Cadherin involviert sind. Ein spezifischer Inhibitor der ERK1/2 Kinasen ist PD98059 (2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-oxanaphthalen-4-one). Nach Behandlung der Melanomzellen mit diesem Inhibitor konnte keine veränderte NFkappaB Aktivität festgestellt werden. Aufgrund dieses Ergebnisses konnte wiederum die Beteiligung der MAP Kinasen ERK1 und ERK2 im untersuchten Signalweg ausgeschlossen werden. Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass die Aktivität der p38 MAP Kinase mit der transkriptionellen Aktivität von NFkappaB verknüpft ist. Außerdem reguliert die E-Cadherin Expression die Aktivität von p38. Mel Im Zellen ohne Cadherin besitzen viel phosphoryliertes p38. E-Cadherin exprimierende Zellen der zwei Modellsysteme haben kein phosphoryliertes p38.

Desweiteren haben wir nach Kinasen gesucht, die oberhalb von p38 an der Signalkaskade von E-Cadherin beteiligt sein könnten. Allerdings gestaltete sich diese Suche sehr schwierig, denn die MAP Kinase Signalwege verzweigen sich sehr stark und es entstehen im Laufe neuer Forschungen immer wieder neue Zusammenhänge für die gegenseitige Aktivierung der Kinasen. Als Beispiel haben wir auch die Beteiligung der MAP Kinase Kinase Kinase MEKK1 im Hinblick auf die NFkappaB Regulation untersucht. Literatur wies darauf hin, dass MEKK1 an der Transformation von Melanozyten zu Melanomzellen beteiligt ist, indem diese Kinase die p38 Aktivität erhöht und NFkappaB Aktivität reguliert (Wang und Richmond, 2001).

In unseren Experimenten steigerte die transiente Transfektion eines Plasmides, welches zu der Expression von MEKK1 führt, in Mel Im Zellen die NFkappaB Aktivität jedoch nicht.

Auch unterhalb des Signalweges der MAP Kinase p38 untersuchten wir die Expression und Phosphorylierung des Zielproteins MAPKAP-2 Kinase. Eigentlich hätte das Zielprotein MAPKAP-2 seine Phosphotransferase-Funktion ausüben müssen und das Substratmolekül HSP27 (heat shock protein 27) phosphorylieren sollen. Im Western Blot wurde daher die Phosphorylierung des Proteins HSP27 nach der Durchführung des MAPKAP-Assay überprüft, in dem der Phosphotransferase Reaktion zusätzlich ATP zugeführt worden ist. Die Beteiligung dieses Moleküls an dem untersuchten Signalweg konnte allerdings experimentell ausgeschlossen werden. Die Proteinextrakte der Zellen mit phosphorylierter p38 Kinase (N-Cadherin exprimierende

Zellen) und der Zellen mit unphosphorylierter p38 Kinase (E-Cadherin exprimiernde Zellen), wiesen keine Unterschiede in der Phosphorylierung von HSP27 auf.

Neuere Literatur wies dem Molekül MSK1 (mitogen- and stress activated protein kinase 1) eine Rolle als Zielmolekül von p38 und ERK zu, welches direkt p65 phosphorylieren kann (Vermeulen et al., 2002; Vermeulen et al., 2003). Daher untersuchten wir ebenfalls die Aktivität von MSK1 im malignen Melanom. Der für MSK1 spezifische Inhibitor H89 zeigte aber keine Wirkung auf die NFkappaB Aktivität in Luciferase Reportergenassays.

Daher konnte bisher keines der oben erwähnten Moleküle der Signalkaskade zwischen E-Cadherin, p38 und NFkappaB zugeordnet werden. Nur das im Kapitel 3.3.3 erwähnte Molekül beta-Catenin fand seinen Platz in der untersuchten Signalkaskade.