Untersuchung der Funktionalität des S-Layers mit Hilfe des Laborstammes Slp90

Um Fragen hinsichtlich einer möglichen Funktionalität des S-Layer Proteins Slp90 beantworten zu können, wurden vergleichende Studien zwischen dem Wildtypstamm SP5/1 und der Labormutante Slp90 angestellt. Zunächst sollte hierzu geklärt werden, ob ein Fehlen des Oberflächenproteins einen physiologischen Nachteil, insbesondere im Bezug auf eine Oxidation von Pyrit, nach sich zieht. Ein direkter Gradmesser für die Umsatzrate von Pyrit war die Bestimmung des gelösten Fe²⁺ über einen längeren Zeitraum hinweg (s.a.

Gleichung [1], Abschnitt I.2). Des Weiteren sollte für das Protein Slp90 eine Beteiligung an der Komplexierung von Fe³⁺ und dem damit verbundenen Zusammenhang zu EPS (Sand und Gehrke, 2006) erörtert werden. Außerdem gab es Hinweise in früheren Arbeiten, dass es in Kulturen des, üblicherweise stäbchenförmigen, Isolates SP5/1 zu annähernd kokkoiden Zellformen kommen kann (Huber, 1987). Aufgrund dessen stand auch eine mögliche, Zellform-bestimmende bzw. -erhaltende Funktion des S-Layers sowie Unterschiede im Aufbau der Zellwand im Fokus elektronenmikroskopischer Untersuchungen. Zusätzlich

wurde bei jeder Probennahme die Zellzahl lichtmikroskopisch bestimmt (II.5.1.2); eine Unterscheidung zwischen planktonischen und sessilen Zellen konnte durch eine Färbung der Zellen mit DAPI (II.5.1.3) erreicht werden.

2.2.1 Identifikation des S-Layer defizienten Laborstammes Slp90

Im Laufe der Untersuchungen am S-Layer des Isolates SP5/1 kam es zu Schwierigkeiten hinsichtlich einer Aufreinigung des Proteins. Weder in negativ-kontrastierten Suspensionspräparaten noch im Rahmen einer Gelelektrophorese konnte das mutmaßliche Protein nachgewiesen werden. Da an diesem Punkt die Möglichkeit in Betracht gezogen wurde, dass es sich bei dem untersuchten Stamm um einen „Laborkrüppel“ handeln könnte, welcher durch wiederholte Überimpfung vom Wildtyp abweichende Eigenschaften entwickelte, wurde der Stamm SP5/1 aus der Bakteriensammlung des Lehrstuhls Mikro-biologie (Universität Regensburg) erneut angezogen. Anschließend wurden die Experimente parallel zu dem, aufgrund des fehlenden S-layer Proteins, Slp90 genannten Laborstammes durchgeführt. Hierbei zeigte sich nach einer S-Layer-Präparation mit 1.5 % Genapol in MES-Puffer (pH 6.0), dass bei sowohl bei SP5/1 als auch bei Slp90 Proteine im SDS-Gel nachweisbar waren, welche für die Lebensfähigkeit der Organismen essentiell sind. Hierzu zählen unter anderem das bereits unter III.2.2 beschriebene Chaperonin GroEL oder das

‚major outer membrane protein 40‘. Jedoch trat bei dem frisch angezüchteten Wildtypstamm bei etwa 85 kDa eine zusätzliche prominente Bande auf, welche in der Präparation des Laborstammes nicht nachzuweisen war (Abbildung 20 A). Für dieses Protein, welches den mutmaßlichen S-Layer darstellt, konnte in diesem Zusammenhang nun auch die N-terminale Sequenz bestimmt werden. Weitere Hinweise hinsichtlich der eindeutigen Identität der 85 kDa-Bande lieferten Suspensionspräparate der S-Layer-Präparationen. Im Gegensatz zu den unstrukturierten Proteinaggregaten, wie sie bei Slp90 vorlagen (Abbildung 20 B), konnten geordnete 2D-Kristalle der S-Layer-Untereinheiten nur in Proben des Wildtypstammes SP5/1 nachgewiesen werden (Abbildung 20 C).

Abbildung 20: Präparation des S-Layers der Stämme SP5/1 und Slp90. Die Anzucht erfolgte unter Standardbedingungen auf Pyrit (II.2.2.1). (A) SDPAGE (10 % AA) zur Auftrennung der Proteine in der S-Layer-Präparation von Slp90 (Spur1) und SP5/1 (Spur 2) mit 1.5 % Genapol X-080 in MES-Puffer (pH 6.0). Silberfärbung. Negativkonstrastierte Suspensionspräparate dieser S-Layer-Extraktionen zeigten ein ungeordnetes Proteingemisch (B). Lediglich bei SP5/1 wurden strukturierte S-Layer gefunden (C). Balken:

je 500 nm.

2.2.2 Ermittlung der physiologischen Aktivität

Anhand einer kontinuierlichen und zeitabhängigen Aufzeichnung der Konzentration an Fe²⁺ -Ionen ließ sich die physiologische Aktivität der Stämme SP5/1 und Slp90 vergleichend darstellen. Das in Lösung gehende Fe²⁺ stand hierbei in direktem Zusammenhang zur Oxidation von FeS2 (Gleichung [1], Abschnitt I.2). Die Konzentration wurde dabei mit dem Ferrozin-Assay nach Lovley und Phillips (1986; s. a. II.6.3) photometrisch bestimmt. Für eine quantitative Bewertung der Fe²⁺-Konzentration war die Zelldichte ein entscheidendes Kriterium. Da sich im Verlauf der gesamten Inkubationsperiode kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Entwicklung der Zellzahlen (etwa 5 x 10⁸ Zellen/ml) zeigte, konnte dieser Faktor jedoch vernachlässigt werden.

Sowohl in den Kulturen des Isolats SP5/1 wie auch des Laborstammes Slp90 war nach einem leichten Rückgang der Fe²⁺-Konzentration zu Beginn des Experiments nach etwa 100 Stunden ein steter und gleichmäßiger Anstieg zu erkennen. Bezüglich der rückläufigen Fe²⁺

-Konzentration konnte eine anfängliche Oxidation von gelöstem Fe²⁺ zu Fe³⁺ nur vermutet werden. Ebenso verhielt es sich mit der Annahme, dass das produzierte Fe³⁺ nach 100 h zu einer steigenden Oxidation des Pyrits beitrug, wodurch vermehrt Fe²⁺ in Lösung ging. Somit würde die Menge an neu gebildetem Fe²⁺ den Betrag der Rückoxidation zu Fe³⁺ übersteigen.

Die bei der abiotischen Pyrit-Oxidation verbrauchten Fe³⁺ Ionen würden dabei wiederum durch die Organismen aus Fe²⁺ regeneriert und stünden für eine erneute Reaktion zur Verfügung. Bezüglich der Konzentration an gelöstem Fe²⁺ wurde deutlich, dass diese beim Stamm Slp90 mit 4.3 mg/ml nach 600 h nur unwesentlich geringer ausfiel, als beim Wildtyp SP5/1, für den 4.7 mg/ml gemessen werden konnten (Abbildung 21). Damit konnte in diesem Zusammenhang die Aussage getroffen werden, dass der S-Layer keinen entscheidenden Einfluss auf die physiologische Aktivität im Sinne der Oxidation von Pyrit hatte.

Abbildung 21: Zeitanhängiger Verlauf der Fe²⁺-Konzentration über die Zeit beim Wachstum der Stämme SP5/1 und Slp90. Die Bestimmung der Fe²⁺-Konzentration erfolgte mit Hilfe des Ferrozin-Assay nach Lovley und Phillips (1986; siehe auch II.6.3).

2.2.3 Komplexierung von Fe³⁺-Ionen und Verlauf des pH-Wertes

Im Vergleich zu dem relativ einheitlichen zeitlichen Verlauf der Fe²⁺-Konzentration, zeigten sich bei der Bestimmung von Fe³⁺ deutliche Unterschiede zwischen den Stämmen SP5/1 und Slp90. Beim Wildtyp war ein relativ geringer Anstieg an Fe³⁺-Ionen zu beobachten.

Nach 600 h betrug die Konzentration 0.35 mg/ml (Abbildung 22). Im Gegensatz dazu war für 0

1000 2000 3000 4000 5000 6000

0 100 200 300 400 500 600

Ko n ze n tr a ti o n F e

[μg /ml]

Zeit[h]