Adhäsionsversuche und Motilität

1.4.1 Etablierung neuer Trocknungsverfahren für die Rasterelektronen-mikroskopie

Um in der Rasterelektronenmikroskopie eine möglichst hohe Auflösung bei der Bildgebung zu erreichen, war es wichtig, die Präparation der Zellen als limitierenden Faktor soweit wie möglich zu optimieren. Ein entscheidender Punkt war hierbei eine adäquate Dehydratisierung der Proben, um potentielles nachträglichen Entwässerung und Form-veränderungen der Zellen im Hochvakuum zu verhinndern, was Aussagen über Vorkommen und Erscheinungsbild feiner und diffiziler Zellstrukturen wie Flagellen, Pili oder das regelmäßige Gitter des S-Layers erschweren könnte.

Eine gute Strukturerhaltung lieferte hierbei die Dehydratisierung der Proben nach der Standardmethode (siehe II.5.3.1). Obwohl diese Methode sogar die Präparation kompletter Kolonien von Paenibacillus uliginosus auf Agarplatten ermöglichte (Abbildung 9 A, B), war die geringe Anzahl an Proben, die gleichzeitig bearbeitet werden konnten auf drei bis vier begrenzt. Aus diesem Grunde war es erforderlich, weitere Methoden zu entwickeln, die die Handhabung großer Probenzahlen ermöglichte. Eine hierfür entwickelte Hochdurchsatz-methode (II.5.3.2), bei der die Proben in der Gefriertrocknungsanlage BETA 1-16 anstatt in der Hochvakuum-Bedampfungs- und Gefrierätzanlage gefriergetrocknet wurden. Dieses stellte einen Kompromiss zwischen optimaler Strukturerhaltung und schneller Präparation vieler Proben dar. Auch wenn letztere mit dieser Methode deutlich schlechter war als bei der Standardmethode, ermöglichte sie dennoch die Darstellung von Zellanhängen bei M.

kandleri (Abbildung 9 D) oder von S. solfataricus P2 (Abbildung 44). Neben der Hochdurch-satzmethode wurde für Experimente, die lediglich eine quantitative Bestimmung adhärenter Zellen auf diversen Oberflächen ermöglichen sollte, die Entwässerung bei Raumtemperatur mit Hilfe von Ethanol in ansteigender Konzentration durchgeführt (II.5.3.3). Trotz der qualitativ schlechten Strukturerhaltung der Zellen, bei denen weder Zellanhänge noch der S-Layer zu erkennen waren (vgl. Abbildung 11), erlaubte es diese Methode, die Adhäsion von Acidithiobacillus an unterschiedlichen Materialien elektronenmikroskopisch zu untersuchen (Abbildung 13).

1.4.2 Adhäsion von Acidithiobacillus an verschiedene Oberflächen

Die in diesem Zusammenhang durchgeführten Adhäsionsversuche wurden mit den Isolaten HV2/2 und SP5/1 sowie dem Laborstamm Slp90 durchgeführt. Die Anheftung aller drei getesteter Stämme an die Oberfläche von Pyritkristallen konnte sowohl ichtmikroskopisch mit

Abbildung 9: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zur Veranschaulichung unterschiedlicher Trocknungsverfahren. (A) und (B) Kolonie von P. uliginosus, gewachsen auf einer Agar-Platte.

Gefriertrocknung nach II.5.3.1. (C - F) M. kandleri gewachsen auf Holz. Gefriertrocknung nach II.5.3.2.

Balken: 50 μm (C), 20 μm (A) und 5 μm (B, D-F).

Hilfe einer DAPI-Färbung (II.5.1.3) als auch mit dem Rasterelektronenmikroskop (II.5.3) gezeigt werden. Bei Langzeitversuchen führten Beobachtungen DAPI-gefärbter Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop zu der Erkenntnis, dass im Falle von HV2/2 etwa 95 % und bei SP5/1 etwa 30 % der Zellen auf der Pyritoberfläche adhärierten. Hierbei war insbesondere bei letzterem Stamm gelegentlich die Ausbildung einer EPS-ähnlichen Substanz zu beobachten, in welche die Zellen eingebettet zu sein schienen (Abbildung 10 B, Abbildung 11).

Abbildung 10: Adhäsion der Stämme SP5/1 (A, B) und HV2/2 (C, D) an Pyrit. Die Organismen wurden unter Standardbedingungen inkubiert. (A) und (C): Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme DAPI-gefärbter Zellen (weiße Pfeile), entsprechend II.5.1.3. (B) und (D): Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Zellen auf Pyritkristallen (schwarze Pfeile) unterschiedlicher Kristallorientierung, teilweise umgeben von EPS (schwarze Pfeilspitzen). Präparation nach II.5.3.1. Balken: je 20 μm.

Abbildung 11: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme des Isolates SP5/1, gewachsen auf Pyrit und entsprechend II.5.3.1 präpariert. Die weißen Kreise in (A) und (B) markieren vermutlich EPS. (C) Bei dieser Art der Präparation ist der streifenförmige S-Layer immer noch sichtbar; mit freundlicher Genehmigung von G. Wanner. (D) Darstellung vereinzelter freier Zellen (schwarze Pfeilspitzen) und von EPS, in welches die Zellen eingebettet sind (weiße Pfeile). Balken: 5 μm (A, D) und 500 nm (B, C).

Fehlte diese Substanz, konnte bei stärkerer Vergrößerung auch hier wieder der streifenförmige S-Layer dokumentiert werden. Der Laborstamm Slp90 war wie SP5/1 ebenfalls in der Lage, sich an Pyrit anzuheften. Ein Kurzzeitversuch über einen Tag adhärierten eta 90 bis 95 % der Zellen des Stammes SP5/1 verglichen 80 % im Fall von Slp90. Der Unterschied war allerdings nicht signifikant genug, um eine Abhängigkeit der Adhäsion vom S-Layer Protein in Betracht zu ziehen. Sowohl für den Stamm HV2/2 wie auch für SP5/1 konnte ein Wachstum auf Kohle-befilmten Goldgrids nachgewiesen werden (Abbildung 12). Neben Flagellen wiesen dabei die Zellen des Stammes SP5/1 auch dünnere,

Pili-ähnliche Zellanhänge mit einem Durchmesser von 6 bis 7 nm auf. Jene Strukturen konnten auch am Isolat HV2/2 beobachtet werden, jedoch in weitaus höherer Zahl (Abbildung 12 G, H). Für den Laborstamm Slp90 konnte bisher keine Adhäsion auf Kohle-befilmten Goldgrids dokumentiert werden.

Abbildung 12: Suspensionspräparate der Isolate SP5/1 (A–E) und HV2/2 (F–H), gewachsen auf Kohle-befilmten Goldgrids mit Pyrit als Substrat (II.10.1); (A–G) Kontrastierung mit Uranylacetat, (H) Platin/Kohle-Bedampfung (II.5.2.1). Zellteilungsstadien adhärenter Zellen von SP5/1. (B) Vergrößerte Darstellung der Flagelle aus (C). (D) und (E): Pili-artige Zellanhänge an der Zelloberfläche von SP5/1. (F) Zellteilungsstadium von HV2/2. (G) und (H): Pili-artige Zellanhänge an der Zelloberfläche von HV2/2. Balken: 500 nm (A–D, F–H) und 200 nm (E).

Sowohl auf Glas wie auch auf Glimmer konnten vereinzelt Zellen der Stämme SP5/1 und Slp90 gefunden werden (Abbildung 13). Jedoch war ihre Anzahl auf diesen Oberflächen derart gering, dass hier, ebenso wie für den Stamm HV2/2, eine gezielte Adhäsion mehr oder weniger ausgeschlossen werden konnte. Vermutlich handelte es sich bei den vorgefundenen Bakterien um planktonische Zellen, welche durch die Trocknung auf der Oberfläche verblieben waren. Für keinen der untersuchten Acidithiobacillus-Stämme konnte eine Interaktion mit Holz dokumentiert werden.

Sowohl für das Isolat HV2/2 als auch für SP5/1 konnte eine aktive Bewegung der Zellen unter dem Lichtmikroskop (II.5.1.1) beobachtet werden. Die Bewegung schien dabei durch die Rotation der Flagelle zu erfolgen. Eine derartige Rotation wurde mehrmals beim Stamm SP5/1 beobachtet, wenn Zellen mit der Flagelle am Objektträger adhärierten. Der Zellkörper drehte sich dabei für einige Sekunden in eine Richtung, um nach einer kurzen Unterbrechung die Drehrichtung der Rotation umzukehren.

Abbildung 13: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Stämme SP5/1 und Slp90 auf abiotischen Oberflächen. (A) Stamm SP5/1 auf Glas. (B – D) Slp90 auf Glimmer. Die Zellen wurden entsprechend II.5.3.3 bei Raumtemperatur entwässert. Balken: je 1 μm.