Untersuchung der Proben während der Aufreinigungsschritte

Das α-Toxin wurde im Ausgangsmaterial und in den Fraktionen während der chro-matografischen Reinigung auf Grund seiner zytotoxischen Eigenschaften mittels Zytotoxizitätstests nachgewiesen.

Die Fraktionen waren unsteril. Die standardgemäße Zugabe von Antibiotika in das Zelltestmedium war jedoch hinreichend, kontaminationsfreies Wachstum in den Testplatten zu gewährleisten.

Da die in der Chromatografie verwendeten Pufferlösungen nicht zelltoxisch waren (Kap. 3.2.3.3), konnten Proben aus den Fraktionen der chromatografischen Aufreini-gung direkt, ohne weitere Vorbereitungsschritte, in Zellkulturtests eingesetzt werden.

3.5.1.2 Darstellung des Toxins in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Die Proteine, inklusive des α-Toxins, in den Proben wurden in denaturierenden Po-lyacrylamidgelen (LAEMMLI 1970) elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurden die Banden durch eine Silberfärbung sichtbar gemacht.

3.5.1.2.1 Material

In einer Gießvorrichtung des Electrophoresis Cell-Systems Mini-Protean II (BIO -RAD) wurden 10-%ige diskontinuierliche Polyacrylamid-Minigele angefertigt (Re-zepte und Anfertigung der Gele: Anhang, S. XIII+IX) und nach der Polymerisierung in Elektrophoresekammern desselben Herstellers eingesetzt. Die Kammern wurden zur Durchführung der elektrophoretischen Läufe an ein Power Pac 3000-Gerät, ebenfalls von BIO-RAD, angeschlossen.

3.5.1.2.2 Methoden

Die Proben wurden im Verhältnis 1:1 mit SDS-haltigem Probenpuffer (Anhang, S.

IX) verdünnt.

Üblicherweise werden die Proben zur vollständigen Reduzierung der Disulfidbrük-ken für 3 min auf 100 °C erhitzt. Oft wird auch Dithiothreitol (DTT) als reduzieren-des Agens dem Probenpuffer zugesetzt. Voruntersuchungen hatten ergeben, dass beide Verfahren keine deutlicheren Banden und keine Erhöhung der Nachweisemp-findlichkeit mit sich brachten. Es wurde daher auf eine Erhitzung und die Zugabe von Dithiothreitol verzichtet.

Die Gele wurden mit Laufpuffer (Verdünnung 1:10) überschichtet und Proben und Proteinstandard (Silver Stain SDS-PAGE Standard, Low Range, BIORAD oder High molecular weight standard mixture for SDS PAGE, SIGMA) aufgetragen. Die Elek-trophorese erfolgte nach dem folgendem Protokoll:

5 min 100 V

40 min 200 V

5 min 100 V

Zur Silberfärbung (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, Silver Staining Protocol for Proteins; Protokoll und Rezepte der Lösungen: Anhang, S. X+XI) wurden die Gele vorsichtig aus den Kammern gelöst und gegebenenfalls markiert.

Während der Färbung, die per Hand erfolgte, wurde die Färbewanne für die jeweils vorgegebene Einwirkdauer auf einem Schüttler langsam bewegt.

Die gefärbten und konservierten Gele wurden zunächst in einem Geldokumentations-system (Gel Print 2000i) fotografiert (Ausdrucke: Digital Graphic Printer UP-D 860 E). Die Auswertung der gespeicherten Bilddaten (.tif-Format) zur Bestimmung der spezifischen Molekülmasse an Hand der Proteinstandards erfolgte mittels des Pro-grammes RFLP-Scan Plus Version 3.0, SCANALYTICS.

Die Gele wurden durch Trocknung auf saugfähigem Filter-Papier im Gel Dryer ge-trocknet und anschließend in Plastikbeuteln luftdicht eingeschweißt.

3.5.1.3 Immunoblot 3.5.1.3.1 Seren

Internationaler Standard:

Es wurde der internationale Anti-C. septicum-Standard der WHO, Weybridge, ver-wendet, ein Hyperimmunserum aus Pferden.

Laborinterner Serumstandard:

Vier Kaninchen (Deutsche Riesen, ca. drei Monate alt) waren mit toxoidiertem Kul-turüberstand von C. septicum Referenzstamm NC 547 aus dem Batch 97 FS-2 im-munisiert worden.

Für zwei der Kaninchen wurden dem Impfstoff 4 mg/ml Aluminiumhydroxidgel (Al(OH)3-Gel) als Adjuvans zugesetzt. Für die anderen beiden Kaninchen wurde eine kommerzielle Formulierung (Montanide ISA 206, SEPPIC) als Adjuvans ausgewählt.

Das Mischungsverhältnis Toxoidlösung zu Öladjuvans betrug 1:1.

Im Serum der beiden Kaninchen, deren Impfstoff mit Adjuvans der Firma SEPPIC

versetzt worden war, wurden nach der zweiten Immunisierung in Serumneutralisati-onstests (Kap. 3.6.2) zufriedenstellende Titer von 2916, resp. 3163 anti-zytotoxi-schen (= serumneutralisierenden) Einheiten pro ml (SNE/ml) nachgewiesen. Die Tiere wurden zur Serumgewinnung entblutet.

Die anderen beiden Kaninchen wurden ein drittes Mal geimpft und dann, mit Titern von 2529 bzw. 7186 SNE/ml im Serum, entblutet.

Die Seren aller vier Tiere wurden gepoolt und als laborinterner Antiserumstandard verwendet. Der Antikörpertiter des Serumpools gegen Toxin des Fermenterbatch 97 FS-2 betrug 4080 SNE/ml.

3.5.1.3.2 Geräte, Membranen und Lösungen

Für die Western Blots wurde eine Mini Trans-blot Electrophoretic Transfer Cell (BIO-RAD) verwendet. Der Transfer der Proteine vom Gel auf die Blotmembran er-folgte mit dem Power Pac 3000-Gerät (BIO-RAD).

Getestet wurden zunächst zwei verschiedene Membrantypen, eine Cellulosenitrat-membran (0,45 µm M^ICRON) und eine hydrophobe PVDF-Membran. Immunoblots

mit der Cellulosenitratmembran hatten in Vorversuchen schärfere Banden und eine geringere Hintergrundfärbung ergeben, als Blots mit der PVDF-Membran, daher wurden Cellulosenitratmembranen verwendet.

Die Lösungen für die Durchführung des Blots sind im Anhang (S. XI) spezifiziert.

Antikörperlösungen:

• Internationaler Standard:

1: 6400 in Lösung 4 vorverdünnt

• Laborstandard (Kaninchenserumpool) 1: 40 in Lösung 4 vorverdünnt

• Anti-IgG Kaninchen, phophatasemarkiert:

1: 20000 in Lösung 4 vorverdünnt

• Anti-IgG Pferd, phophatasemarkiert:

1: 30000 in Lösung 4 vorverdünnt 3.5.1.3.3 Methode

Für das Immunoblotverfahren wurden SDS-Polyacrylamidgele wie beschrieben an-gefertigt.

Die Gele wurden nach der Elektrophorese nach Anweisungen des Herstellers in die Blotkammern eingebaut. Das Sandwich wurde mit Transferpuffer (Lösung 1) über-schichtet und die Proteine in 18 h bei 30 V, 40 mA unter Rührung und Kühlung auf die Blotmembran übertragen.

Entwicklung:

• Eine Blotmembran wurde zur Entwicklung in ein Gefäß mit Blocking Puffer (Lö-sung 2) gegeben und 30 min bei 37 °C im Brutschrank geschwenkt.

• Anschließend wurde sie zweimal 5 min in Waschpuffer (Lösung 3) gewaschen.

• Nach Zugabe der Antikörperlösung (Kaninchen- oder Pferdeserum) wurde die Blotmembran für weitere 60 min bei 37 °C geschwenkt.

• Zur Entfernung von Serumresten erfolgte ein fünfmaliges Waschen der Membran in Waschpuffer.

• Der zweite vorverdünnte Antikörper (Anti-Kaninchen oder Anti-Pferd) wurde zugegeben und 45 min bei 37 °C geschwenkt.

• Die Membran wurde erneut fünfmal in Waschpuffer gewaschen.

• Die Färbelösung (Lösung 5) wurde zugegeben und die Membran bis Eintreten der Färbung nach 5-10 min geschwenkt. Die Färbereaktion wurde durch Spülen mit destilliertem Wasser gestoppt und die gefärbten Membranen bei Raumtempe-ratur getrocknet.

3.5.1.4 Quantitativer Proteinnachweis (nach LOWRY 1951)

Die Bestimmung des Gesamtproteingehaltes in den Lösungen wurde nach einer mo-difizierten Variante der Methode von LOWRY (1951) durchgeführt. Die Zusammen-setzungen aller Testlösungen und das Protokoll der Proteinbestimmung sind im An-hang (S. XII) aufgeführt.

Die Proben mussten in amidfreien Lösungsmitteln vorliegen, da der Test diese Bin-dungsform nicht-selektiv nachweist. So ergibt beispielsweise probenfreier

HEPES-Puffer eine positive Reaktion. In Tris-HEPES-Puffer hingegen wurde, anders als bei BRIESE (1997), keine Farbreaktion beobachtet.

In bereits gereinigten Fraktionen konnte nach einer quantitativen Proteinbestimmung die Toxizität in ein Verhältnis zur Proteinmasse gesetzt werden.