Ungerichtete Mutagenese der S. cerevisiae Galactose Permease Gal2 und Erstellung von

Wie in der Einleitung (1.3.1) erläutert, zeichneten vor allem drei Eigenschaften die Galactose Permease Gal2 aus S. cerevisiae als einen vielversprechenden Kandidaten für die Untersuchungen in dieser Arbeit aus:

 die Fähigkeit neben Galactose auch Glucose zu transportieren

 Glucose mit hoher Affinität zu transportieren

 als einziges Transportprotein Arabinose zu transportieren

Einige Untersuchungen von Kasahara und Kollegen (Kasahara und Maeda, 1998; Kasahara &

Kasahara, 2000a; 2000b; 2003; 2010; Kasahara et al. 2004; 2011) an verschiedenen Hexosetransportern (Hxt) konnten bestimmmte Bereiche und Aminosäurepositionen innerhalb der Transportproteine identifizieren und manchen auch eine Funktion beim Glucosetransport zuordnen. Aufgrund der hohen Sequenzhomologie der sieben Hexosetransporter (Hxt1-7) mit Gal2 von 64-71 % (Saccharomyces Genome Database), wurde in dieser Arbeit vermutet, dass ebenso in Gal2 die transportrelevanten Aminosäuren in diesen Bereichen zu finden sein könnten.

Für die Erstellung einer Mutantenbibliothek wurde daher ein 185 Aminosäuren langer Bereich im gal2-Gen ausgewählt. Dieser umfasst einen Teil des großen zytoplasmatischen Loops zwischen den Transmembranbereichen (TM) 6 und 7, bis zur TM10 und dem anschließenden Loop des Transportproteins bis TM11 (Abbildung 10). Dieser Abschnitt wird von den Restriktionsschnittstellen für BamHI und MunI flankiert, welche benutzt wurden, um ihn aus dem pRS313-Gal2 mit der wildtypischen Galactose Permease herauszuschneiden. Als Mutagenesemethode wurde das Verfahren der error-prone PCR (epPCR) angewendet (Material, 2.2.11). Die hier eingesetzten PCR Primer (Material, 2.1.6) wurden so konstruiert, dass die Restriktionsschnittstellen vor ungewollten Mutationen geschützt blieben. Die Mutationsparameter während der PCR Reaktion wurden so eingestellt, dass die Mutationsrate bei bis zu 4 Punktmutationen im genannten Genbereich lag. Nach erfolgter Reaktion wurden die mutierten PCR Fragmente zurück in den Ausgangsvektor pRS313-Gal2 kloniert und 5 µl dieser Mutantenbibliothek zur Überprüfung der Mutationsrate in E. coli XL1-blue Zellen transformiert.

Aus 10 zufällig ausgewählten E. coli-Kolonien wurden die mutierten Vektoren wieder isoliert und die gesamten gal2-Gene sequenziert.

56 3.3.1 Ungerichtete Mutagenese, 1. Runde

Das auf Durchflusszytometrie basierende Screening Assay konnte in der dieser Arbeit vorangegangenen Diplomarbeit (Reznicek, 2011) erfolgreich getestet und etabliert werden. Der S. cerevisiae Transporterdeletionsstamm DS68625 (Δhxt1-7, Δgal2) wurde mit der Gal2 Mutantenbibliothek transformiert und auf Agarplatten mit 2 % Xylose ausplattiert. Nach drei Tagen Inkubation (30°C) wurden die Transformanten durch Schwemmen der Agarplatten in eine Zellsuspension überführt, welcher Xylose als Kohlenstoffquelle (1% Endkonzentration) zugegeben und erneut über Nacht inkubiert (30 °C, 180 rpm) wurde. Nach zweimaligem Waschen der Übernachtkultur (3.220 x g, 15 min) erfolgte die Analyse im Durchflusszytometer, bei welchem pro Agarplatte mit 25 ml Mineralmedium und 0,1 % Xylose genau 100 knospende Hefezellen abgelegt wurden. In dieser ersten Mutageneserunde wurden insgesamt 13.700 Einzelzellen auf 137 Agarplatten abgelegt. Diese Platten wurden daraufhin bei 30°C im Brutschrank inkubiert und auf Koloniebildung hin beobachtet.

Nach eineinhalb Tagen Inkubation konnte auf vereinzelten Agaplatten winzige Koloniebildung beobachten werden. Diese Einzelkolonien wurden am Plattenboden markiert und die Agarplatten weiter inkubiert. Nach drei Tagen zeigten die Agarplatten zahlreiche und verschieden große Einzelkolonien im abgelegten Raster von 10 x 10 Zellen, wie in Abbildung 9 zu sehen ist. Unter den markierten Einzelkolonien wurden daraufhin die 80 größten mit sterilen Zahnstochern auf frische Agarplatten mit ebenfalls exakt 25 ml Mineralmedium und 0,1 % Xylose überführt und erneut bei 30°C inkubiert. Nach weiteren vier Tagen wurden die neun größten unter diesen 80 Kolonien ausgewählt, um sie auf Wachstum in Flüssigmedium zu untersuchen.

Abbildung 10. Topologiemodell der wildtypischen Gal2 Permease aus S. cerevisiae.

Topologiemodell der wildtypischen Galactose Permease Gal2 nach SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/). Das Extrazytoplasma befindet sich oberhalb, das Zytoplasma unterhalb der TM Helices. Die Zahlen bezeichnen die Transmembranhelices. Restriktionsschnittstellen flankieren den jeweils mutierten Genbereich: in der 1. und 2. Mutageneserunde zwischen BamHI und MunI; in der 3. Mutageneserunde zwischen EagI und MunI.

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Um für die Wachstumsexperimente eine Adaptierung des Transporterdeletionsstammes DS68625 an die Selektionsbedingungen auszuschließen, wurde die Vektor-DNA zunächst aus den neun Kandidaten isoliert und der Deletionsstamm mit den selbigen Vektoren frisch transformiert.

Die Charakterisierung der einzelnen Kandidaten erfolgte daraufhin in biologischen Triplikaten in Schüttelkolben (250 ml) mit 50 ml Mineralmedium und 2 % Xylose. Als Kontrolle wurde der Deletionsstamm DS68625 mit dem wildtypischen Vektor pRS313-Gal2 (Gal2), sowie dem leeren Vektor pRS313 transformiert und ebenfalls getestet. Unter den neun getesteten Kandidaten zeigte daraufhin ein Kandidat im Vergleich zum Wildtyp ein schnelleres Wachstum (Abbildung 11). Eine Sequenzierung des gal2-Gens dieses Kandidaten zeigte einen Aminosäureaustausch an Position 311: Hier kam es zum Austausch eines Leucins durch ein Arginin. Neben dieser Aminosäuresubstitution wurden noch drei stille Mutationen identifiziert. Diese Gal2 Variante aus der ersten Mutageneserunde erhielt darauf die Bezeichnung 1.1 (Tabelle 1).

Abbildung 11. Identifizierte Gal2 Variante 1.1 nach der ersten Mutagenesesrunde.

Wachstumsverlauf des Transporterdeletionsstammes DS68625 (Δhxt1-7, Δgal2) transformiert mit der Gal2 Variante 1.1 () in Mineralmedium mit 2 % Xylose als C-Quelle, identifiziert nach der ersten Mutageneserunde aus insgesamt 13.700 Hefezellen. Als Kontrolle diente DS68625 transformiert mit dem wildtypischen Transportprotein Gal2 () und dem Leervektor pRS313 ().

Der Wachstumsverlauf wurde anhand der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) bestimmt. Die Fehlerbalken repräsentieren die Ergebnisse aus drei parallelen Experimenten.

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Tabelle 1. In dieser Arbeit generierte und identifizierte Gal2 Varianten.

Bezeichnung Mutationen Mutageneserunde

1.1 L311R (L362L, D363D, K469K) 1. Runde

Gal2 Variante 1.1 diente als Templat für die 2. Mutationsrunde, daher beinhalten alle weiteren Varianten diese Mutationen

2.1 L301R, K310R, N314D, M435T (L343L) 2. Runde

2.2 M435T, S468T (K394K) 2. Runde

2.3 L301R, K310R, N314D, Q425R, S427P, M435T (L343L, I356I)

2. Runde

2.4 M435T (Q329Q, Q338Q, C434C) 2. Runde

Gal2 Variante 2.1 diente als Templat für die 3. Mutationsrunde, daher beinhalten alle weiteren Varianten diese Mutationen (bis auf L343L)

3.1 T386A 3. Runde

3.2 F444L (G151G, I256I) 3. Runde

3.3 (S285S, E367E) 3. Runde

3.4 (D364D) 3. Runde

3.5 Y176H 3. Runde

3.6 Y226C, L280P (I165I, I178I, A250A) 3. Runde

3.7 M339V, L464Q (Y446Y) 3. Runde

( ) stille Mutationen

3.3.2 Ungerichtete Mutagenese, 2. Runde

Diese Gal2 Variante 1.1 diente als Templat für die 2. Mutageneserunde. In dieser wurde der gleiche Bereich (Abbildung 10) mit identischen Mutationsparametern wie in der ersten Runde mutiert.

Dem gleichen Selektionsverfahren wie eben beschrieben folgend, wurden in dieser 2.

Mutationsrunde insgesamt 14.400 knospende Hefezellen auf 144 Agarplatten mit 25 ml Mineralmedium und 0,1 % Xylose abgelegt, diese inkubiert (30°C) und auf Koloniebildung hin beobachtet.

Aus dieser 2. Mutantenbibliothek konnten insgesamt vier neue Kandidaten identifiziert werden, welche eine signifikant schnellere Koloniebildung aufwiesen. Die mutierten gal2-Gene auf den pRS313 Shuttlevektoren wurden aus diesen vier Kandidaten isoliert und sequenziert. Die Sequenzierung zeigte alle vier Kandidaten als neue Gal2 Varianten (Tabelle 1). Neben den Mutationen der Variante 1.1, konnten für die Variante 2.1 die Aminosäurensubstitutionen L301R, K310R, N314D innerhalb der großen zytoplasmatischen Loopregion zwischen TM6/7 identifiziert

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werden. Darüber hinaus wurde in dieser Variante neben einer stillen Mutation an Position 343 ein weiterer Aminosäureaustausch festgestellt: M435T. Diese Substitution konnte ebenfalls in allen der drei übrigen Kandidaten der 2. Mutationsrunde (Varianten 2.2, 2.3, 2.4) identifiziert werden.

Zusätzlich zu den Mutationen aus der Variante 2.1 konnten für die Variante 2.3 die zusätzlichen Aminosäurensubstitutionen Q425R und S427P (beide im extrazytoplasmatischen Loop zwischen TM9/10), sowie eine weitere stille Mutation (I356I) identifiziert werden. Neben der mutierten Position M435T zeigte die Variante 2.2 eine weitere Substitution (S468T) und eine stille Mutation (K394K). Die Variante 2.4 verfügte neben der Aminosäuresubstitution M435T nur über drei stille Mutationen: Q329Q, Q338Q, C434C.

Nach einer frischen Transformation des Teststammes DS68625 mit den sequenzierten Kandidaten der 2. Mutationsrunde wurden diese in flüssigem Mineralmedium auf ihre Xyloseaufnahme hin getestet. Eine gesteigerte Xyloseaffintität sollte hierbei durch die Konzentrationen von 0,45 % (entspricht 30 mM) und 0,1 % (entspricht 6,67 mM) überprüft werden. Neben der Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD600), wurde hierbei zur quantitativen Überprüfung parallel die verbleibende Xylosekonzentration im Medium mittels HPLC Analyse gemessen. Als Kontrollen dienten erneut das wildtypische Transportprotein Gal2, sowie die Variante 1.1 aus der 1. Mutationsrunde und der Teststamm DS68625 transformiert mit dem Leervektor pRS313 (Abbildung 12).

Im Vergleich zum Gal2 Wildtyp zeigten alle identifizierten Varianten aus den beiden Mutageneserunden eine gesteigerte Xyloseaffinität. In den Versuchen mit 0,45 % Xylose zeigten die Gal2 Varianten der 2. Mutationsrunde (2.1-2.4) eine erneute Steigerung gegenüber der Variante 1.1 aus der 1. Runde. Dies äußerte sich durch eine verkürzte Lag-Phase und eine steilere exponentielle Phase, wobei die Variante 2.1 als die schnellste Gal2 Variante beobachtet wurde (Abbildung 12A). Die HPLC Analyse bestätigte diese Beobachtung: nach 62 h konnte für die Variante 2.1 keine Xylose mehr detektiert werden (Abbildung 12B). Zum selben Zeitpunkt wurde für den Wildtyp 0,42 % Xylose (±0,016 %) und die Variante 1.1 0,35 % Xylose (±0,029 %) gemessen. Einen nahezu gleich schnellen Wachstumsverlauf wie 2.1 zeigte Variante 2.3: nach 62 h wurden hier nur noch 0,02 % Xylose (±0,002 %) gemessen (Abbildung 12B).

Die Experimente mit 0,1 % Xylose bestätigten die Beobachtungen für die Gal2 Variante 2.1 und zeigten deren signifikant gesteigerte Xyloseaffinität. Bei dieser Konzentration zeigte diese Variante 2.1 als einzige deutliches Wachstum (Abbildung 12C). Auch diese Beobachtung konnte durch die parallel durchgeführten HPLC Messungen erneut bestätigt werden: Nach 66 h wurden hier nur noch 0,05 % Xylose (±0,002 %) detektiert. Zum selben Zeitpunkt konnte weder für den Wildtyp, noch für die Variante 1.1 aus der 1. Mutageneserunde eine Abnahme der

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Xylosekonzentration oder Wachstum durch Zunahme der optischen Dichte beobachtet werden (Abbildung 12D).