7. Anhang
7.3 Sequenzen
Zwei-Komponenten System eine N-terminale FMN/NADH Bindedomäne und ein Cys4 [2Fe-2S] Cluster kombiniert in der Reduktase Komponente. Dies spricht für die Zugehörigkeit zur Klasse I, bzw.
Unterklasse IA. Damit konnte auch für den Arthrobacter sp. hier erstmals eine Klassifizierung des RHO Enyzmkomplexes vorgenommen werden.
Später entdeckte und charakterisierte RHOs wie die Carbazol DO aus Pseudomonas sp. CA10 (Sato et al. 1997) oder Ferredoxine mit dem seltenen [3Fe-4S] Cluster passten jedoch nur unzureichend in diese traditionelle Einordnung. Ein alternativer und spezifischerer
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Klassifizierungsansatz basiert auf der Substratspezifität und dem Sequenzalignment mit Distanzkalkulation der RHO α-Untereinheiten (Werlen et al. 1996; Nam et al. 2001). Der Schwerpunkt lag hierbei auf der Struktur-Funktions-Beziehung und führte zur Einteilung von vier neuen Familien. Dieser phylogenetische Ansatz beschränkte sich allerdings auf die Analysen der α-Untereinheiten und ignorierte die zugehörigen β-, und ETC Komponenten. Die Kombination beider Aspekte, der terminalen Oxygenase und der ETC Komponenten vereint die Klassifizierung von Kweon et al. (2008) (Abbildung 4). Grundsätzlich basierend auf der Anwesenheit einer β-Untereinheit der terminalen Oxygenase, der unterschiedlichen prosthetischen Gruppen in der Ferredoxin Komponente (einem [2Fe-2S] oder [3Fe-4S] Cluster) sowie der Eigenschaft der Reduktase Komponente (Glutathion-Reduktase (GR)-typ oder Ferredoxin-NAD+ Reduktase (FNR)-typ mit einer [2Fe-2S] Domäne entweder im N-terminalen Bereich (FNRN) oder C-terminalen Bereich (FNRC)), schlägt diese Klassifizierung fünf neue RHO Typen vor:
Typ I) repräsentiert zwei-Komponenten RHOs: bestehend aus einer Oxygenase und einer FNRC-typ Reduktase.
Typ II) repräsentiert zwei-Komponenten RHOs: bestehend aus einer Oxygenase und einer FNRN-typ Reduktase.
Typ III) repräsentiert drei-Komponenten RHOs: bestehend aus einer Oxygenase, einem [2Fe-2S]-typ Ferredoxin und einer FNRN-typ Reduktase.
Typ IV) repräsentiert drei-Komponenten RHOs: bestehend aus einer Oxygenase, einem [2Fe-2S]-typ Ferredoxin und einer GR-typ Reduktase.
Typ V) repräsentiert drei-Komponenten RHOs: bestehend aus einer Oxygenase, einem [3Fe-4S]-typ Ferredoxin und einer GR-typ Reduktase.
Diese allgemein anerkannte Klassifizierung nach Kweon und Kollegen stellt eine der umfassendsten dar und lässt gleichzeitig mit der zunehmenden Anzahl neu identifizierter RHOs eine Erweiterung in zusätzliche Subtypen zu. So beispielsweise in die Subtypen Iα, wenn Vertreter des Typs I über eine terminale Oxygenase mit nur der großen α-Untereinheit verfügen, bzw. des Subtyps Iαβ, wenn die Vertreter des Typs Iα über eine zusätzliche β-Untereinheit verfügen. Wie bereits unter 4.5 beschrieben, zählt die vanA Vanillat Demethylase aus Pseudomonas sp. HR199 zu den Typ I RHOs. Entsprechend der Annotierung und dem „Rieske [2Fe-2S] Cluster“ mit dem 2-His-1-Carboxylat Motiv innerhalb der As-DO1 sowie der N-terminalen FMN/NADH Bindedomäne und dem Cys4 [2Fe-2S] Cluster im C-terminalen Bereich (FNRC-typ) in der Reduktase Komponente der As-DO2 kombiniert (Anhang, 7.3 Sequenzen), fällt die Arthrobacter sp. As-DO1-2 ebenfalls unter diesen RHO Typ I, bzw. dem Subtyp Iα.
133
Die Pi-DO16 konnte aufgrund des fehlenden Eisen-Schwefel Clusters in der Reduktase Komponente dem GR-typ zugeordnet werden und damit zu RHOs vom Typ IV, zusammen mit Vertretern wie der Biphenyl DO aus P. pseudoalkaligenes (Taira et al. 1992) und Carbazol DO aus Sphingomonas sp. (Sheperd & Lloyd-Jones, 1998).
Die unerwartet hohe Anzahl an α-RHOs im Genom von P. immobile gegenüber von nur einer putativen β- und nur wenigen ETC Komponenten zeigt eine ähnlich komplexe Konstellation, wie sie bei verschiedenen Sphingomonas oder Mycobacterium Stämmen beobachtet wird. Mit Stand Oktober 2014 listete die NCBI nicht-redundante Proteindatenbank über 1.300 Einträge von sequenzidentifizierten RHOs. Hiervon ist nur ein kleiner Teil näher bestimmt und lediglich ca. 25
„Standard“ RHOs sind gut charakterisiert und strukturaufgeklärt (Kweon et al. 2008). Darunter zählen beispielsweise die bereits erwähnten Naphthalin oder Biphenyl DOs. Als zentrale Enzyme im Abbau von aromatischen Substraten bieten Datenbanken wie die KEGG Pathway Database (Kanehisa, 2002), UM-BBD (Ellis et al. 2001), UniPathway (Morgat et al. 2012) oder MetaRouter (Pazos et al. 2005) weitere Informationen. Diese zielen dabei jedoch vorwiegend auf den Abbaupfad als Ganzes ab, mit allen darin involvierten Enzymen. Im Hinblick auf die in dieser Arbeit untersuchten RHOs, verfügte die OxDBase (Arora et al. 2009) als erste spezifische Datenbank über Informationen bezüglich sowohl Di- als auch Monooxygenasen. Die 2014 veröffentlichten Datenbanken RHObase (Chakraborty et al. 2014) und AromaDeg (Duarte et al. 2014) fokussieren ihre Einträge speziell auf RHOs oder auf ring-hydroxylierende, und ring-spaltende Dioxygenasen.
Zusammen mit den 25 „Standard“ α-RHOs aus Kweons Klassifikation und den in dieser Arbeit identifizierten α-RHOs aus P. immobile und Arthrobacter sp. als Seedsequenzen konnten mithilfe verfügbarer Sequenzdaten aus der nicht-redundanten Proteindatenbank NCBI zwei RHO Superfamilien erstellt werden, welche sich in weitere Unterfamilien mit >40 % Sequenzhomologie unterteilen (Abbildung 31). 14 der 18 identifizierten Pi-DOs befinden sich dabei in einer gemeinsamen Unterfamilie der RHO Superfamilie 1. Hier befinden sich bis auf die Pi-DO6 alle in der Proteomanalyse identifizierten Pi-DOs, was ihre große Sequenzähnlichkeit aus Tabelle 8 und ihre eigenständige Stellung im Sequenzraum wiederspiegelt.
Über einen Grund dieser hohen Anzahl putativ funktionsgleicher Oxygenasen in P. immobile Stamm E kann durch die hier durchgeführten Untersuchungen nur eingeschränkt Aussage getroffen werden. Der direkte Vergleich der 7 α-RHOs, die in der Proteomsuche identifiziert werden konnten (Tabelle 4 und 8), zeigt konservierte Bereiche innerhalb der Oxygenasen (Abbildung 30). Neben dem hochkonservierten N-teminalen Bereich mit dem charakteristischen Rieske-Motiv, zeigt der C-terminale Bereich neben dem 2-His-1-Carboxylat Motiv einen Wechsel von variablen und konservierten Abschnitten. Dies deutet auf mögliche substratspezifische Unterschiede hin.
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Die ebenfalls in dieser Arbeit untersuchte Bäckerhefe S. cerevisiae verfügt über 18 Gene, welche für Hxt Proteine der gleichen Funktion kodieren. Ähnlich zu den RHOs aus P. immobile zeigen sie eine hohe Homologie untereinander, unterscheiden sich jedoch durch die Transportcharakteristik und Glucosespezifität und werden entsprechend eines externen Signals induziert, bzw. reprimiert (Ozcan et al. 1996; Klockow et al. 2008). Für das Überleben und Wachstum sind jedoch nur 7 der 18 Hxt notwendig und werden abhängig der vorhandenen Substratkonzentration exprimiert (Reifenberger et al. 1995; 1997; Diderich et al. 1999; 2001) (siehe 1.3.1). Es ist demnach vorstellbar, dass auch trotz des bisher nur limitiert bekannten Substratspektrums, ein ähnliches Prinzip bei P. immobile und der Aktivierung der verschiedenen RHOs vorliegt, wonach durch einen Substratstimulus die Transkription des entsprechenden RHO-Gens induziert wird. Hierbei könnte, wie beispielsweise schon bei Sphingomonas beobachtet, die Flexibilität zwischen der Oxygenase- und ETC Komponente einen evolutionären Vorteil bieten (Kweon et al. 2008; Charkraborty et al. 2012). Mit dem Austausch von nur einer Komponente anstatt des gesamten Enzymkomplexes ist eine raschere Adaption auf neue C-Quellen hin möglich.
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Auch die Fusion dieser Mutation mit der von Farwick und Kollegen (2014) identifizierten Position Arginin 376 wirft die Frage auf, ob hierdurch die Transportspezifität weiter verändert werden kann.
Neben der weiteren Aufklärung des Transportmechanismus ist auch die Auswirkung der Mutationen auf die Aufnahme von Arabinose als weiteres nicht-natürliches Substrat in der Biomasse von Bedeutung. Darüber hinaus ließen sich die dadurch gewonnenen Erkenntnisse möglicherweise nicht nur auf die übrigen Hxt in S. cerevisiae übertragen, sondern auch auf weitere verwandte Transportproteine der SPF oder MFS.
Für die Verwertung aufgenommener Substrate und ihre Umsetzung zu neuen chiralen Biomolekülen stellen die Ergebnisse der identifizierten RHOs ebenfalls eine breite Ausgangssituation für weitere Untersuchungen dar. Die grundsätzliche Aktivität von As-DO1 und As-DO1-2 gegenüber Papaverin sowie Pi-DO16 gegenüber Antipyrin sollte durch Anpassung der Expressionsbedingungen gesteigert und das natürliche Substratspektrum durch Biotransformation mit Substratderivaten, bzw. strukturähnlichen Substraten näher bestimmt werden.
Die unerwartet hohe Anzahl an α-RHOs aus P. immobile Stamm E (DSM 1986) in Verbindung mit dem besonderen Substratspektrum dieses Bodenbakteriums und ihrer überwiegend eigenen Stellung im Sequenzraum, zeichnet sie für die Anwendung in neuen Stoffwechselwegen aus. Neben Pi-DO16 erscheint hier vor allem die Pi-DO2 als interessanter Kandidat. Als einziger Vertreter aus P. immobile Stamm E (DSM 1986) befindet sich diese RHO in derselben Unterfamilie wie bereits beschriebene und teils strukturaufgeklärte RHOs. So zum Beispiel die Biphenyl DO aus Pseudomonas sp. (Ohtsubo et al. 2000). Untersuchungen zur Sequenzähnlichkeit, bspw. hinsichtlich der Struktur im aktiven Zentrum, könnten Rückschlüsse auf eine Verbindung zwischen Struktur und Sequenz zulassen. Zusammen mit den übrigen Pi-DOs könnten sich zum einen Antworten zum ungewöhnlichen Substratspektrum von P. immobile Stamm E (DSM 1986) ergeben. Zum anderen würde dies die Grundlage darstellen, mit rationalem oder semi-rationalen Design das aktive Zentrum der Pi-DOs für neue Substrate zu formen und hierdurch die Hydroxylierung neuer und auch nicht-aromatischer Substrate wie bspw. Terpene zu ermöglichen.
Zum Design neuartiger Stoffwechselwege lag der Schwerpunkt dieser Arbeit zum einen auf dem Transport und zum anderen auf der Verwertung nicht-physiologischer C-Quellen in Mikroorganismen, mit den darin involvierten Schlüsselenzymen. Die Nutzung dieser Proteine und Enzyme als Biokatalysatoren im Metabolic Engineering und der synthetischen Biologie ermöglicht die gezielte Herstellung von Natur-, Fein- oder Grundchemikalien auf biotechnologische und nachhaltige Weise.
Durch Protein Engineering der Galactose Permease Gal2 wurde der Transport der nicht-physiologischen Xylose in Saccharomyces cerevisiae gesteigert. Nach insgesamt drei Runden error-prone PCR und dem Screening von 41,200 einzelnen Hefezellen mithilfe eines FACS basierten Screening Assays, konnten acht Gal2 Varianten mit im Vergleich zum Wildtyp gesteigerter Transportfähigkeit für Xylose identifiziert werden. Unter diesen acht Varianten zeigte die Gal2 Variante 2.1 die größte Steigerung der Xyloseaffinität mit gleichzeitig vermindertem Transport von Glucose. Diese Auswirkungen konnten auf fünf Aminosäuresubstitutionen (L301R, K310R, L311R, N314D, M435T) zurückgeführt werden. Mit Ausnahme von M435T wurden alle Mutationen in der großen zytoplasmatischen Loopregion zwischen TM6/7 identifiziert, und deuteten auf den Loop 6/7 und seine mögliche Bedeutung für die Zuckerakzeptanz.
Untersuchungen dieser Variante 2.1 mit gleichzeitiger Verfügbarkeit von jeweils 0,45 % Glucose und 0,45 % Xylose zeigten, dass beide Zucker nahezu gleichzeitig aufgenommen und verwertet werden. Im Vergleich zum Wildtyp äußerte sich dies in einem schnelleren Wachstum. Eine andere Gal2 Variante 3.1, welche eine zusätzliche Aminosäuresubstitution (T386A) innerhalb der TM8 trägt, zeigte ein stark beeinträchtigtes Wachstum mit Glucose, nicht jedoch mit Xylose. Die Verschiebung des Substratpektrums durch Herabsetzen der Glucosepezifität und Steigerung der Xyloseaffinität der Gal2 Variante 2.1 mithilfe des Protein Engineerings, führte zu einem erfolgreichen Ko-Transport beider Zucker bei einer Konzentration von 0,9 %.
Zur Nutzung als Biokatalysatoren für neue Stoffwechselwege, wurden die postulierten Abbauwege der Substrate Chloridazon und Antipyrin in Phenylobacterium immobile Stamm E (DSM 1986) sowie Papaverin in Arthrobacter sp. hinsichtlich der involvierten Schlüsselenzyme näher untersucht. Beide mikrobiellen Genome wurden hierzu mittels de novo Shotgun Sequenzierung bestimmt und funktionell annotiert. Dies lieferte für P. immobile 6 genomische Scaffolds, bestehend aus 3,33 Mbp mit einem GC-Gehalt von 67 % und 3.520 putativen Gesamt-Proteinen. Für Arthrobacter sp. lieferte dies 3 genomische Scaffolds, bestehend aus 4,85 Mbp, einem GC-Gehalt von 62 % und 4.599 putativen Gesamt-Proteinen.
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Mithilfe von Proteomanalysen konnte bei der Suche nach ring-hydroxylierenden (RHO) und ring-spaltenden Dioxygenasen (DO) als Schlüsselenzyme des Upper und Lower Pathway des Papaverinabbaus in Arthrobacter sp. eine Rieske Vanillat O-demethylase Oxygenase (As-DO1-2), eine Zwei-Komponenten RHO vom Typ Iα (nach Kweon et al. 2008), identifiziert werden. Eine Typ I Extradiol-DO (As-ExDO1) inmitten eines möglichen Genclusters und Teil des Lower Pathways konnte ebenfalls identifiziert werden. Nach Klonierung und heterologer Expression der As-DO1-2 und As-ExDO1 in E. coli Rosetta(DE3) pRARE konnte ihre Aktivität gegenüber Papaverin, bzw. Catechol gezeigt werden. Die Ergebnisse der As-DO1-2 und der Hydroxylierung der Methoxygruppen des Papaverins zeigen eine mögliche Ergänzung des postulierten Abbauweges in Arthrobacter sp.
Für P. immobile Stamm E (DSM 1986) zeigte die Annotation des Genoms putative ORFs für insgesamt 18 RHO α-Untereinheiten, von denen sich 2 ORFs auf einem identifizierten, natürlichen Plasmid befinden. Zudem zeigte die Annotation lediglich 1 RHO β-Untereinheit (DO3), 3 Ferredoxine, 2 Ferredoxin-Reduktasen sowie 6 Extradiol-DO. Bezüglich RHOs als ein multi-komponenten Enzymsystem, zeigt dieses numerische Ungleichgewicht eine ungewöhnliche und komplexe genetische Ausstattung von P. immobile Stamm E. Gene für 2 Ferredoxine und 1 Ferredoxin-Reduktase befinden sich zusammen mit einer Dehydrogenase innerhalb eines möglichen Genclusters. Die übrigen annotierten ORFs befinden sich verstreut über das gesamte Genom. Hiervon bildet die geclusterte Anordnung der DO15, 16, 17, 18, 19, 21 und 31 als α-Untereinheiten eine Ausnahme. Diese Anordnung wird durch ORFs unterbrochen, die für eine Tn3 Transposase und Resolvase/Invertase kodieren. Identische Gene der Transposase, Resolvase und DO31 konnten auch auf dem natürlichen Plasmid identifiziert werden. Die Anwesenheit mobiler genetischer Elemente in P. immobile Stamm E zeigen einen genetisch komplexen und variablen Organismus. Zusammen mit der β-Untereinheit, konnten von den 18 annotierten RHO α-Untereinheiten 7 während der Proteomanalyse als potentiell am Abbau von Antipyrin detektiert werden. Die Klonierung eines homologen RHO Enzymkomplexes (Pi-DO16-ETC1) mit anschließender Expression in E. coli JM109(DE3) pRARE2 zeigte eine messbare Aktivität gegenüber Antipyrin als Substrat. Anhand von Sequenzuntersuchungen konnte dieser Enzymkomplex nach Kweon et al. (2008) als RHO System Typ IVa klassifiziert werden. Die Typ III Extradiol DO 3 und 4 (Pi-ExDO3-4), deren ORFs geclustert im Genom vorliegen und ebenfalls in der Proteomanalyse detektiert wurden, wurden in E. coli Rosetta(DE3) pRARE exprimiert. Wie bereits für die ring-spaltenden DO in Arthrobacter sp., konnte anhand von zwei unterschiedlicher Catechol Substrate ihre Aktivität und auch ihre mögliche Beteiligung im postulierten Abbau gezeigt werden.
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Die in dieser Arbeit gezeigte Erweiterung des Substratspektrums eines Transportproteins ermöglicht die Nutzung zusätzlicher C-Quellen. Zusammen mit den hier neu identifizierten Biokatalysatoren bieten die gezeigten Ergebnisse eine vielversprechende Ausgangssituation für das Design neuartiger Stoffwechselwege im Bereich des Metabolic Engineering und der synthetischen Biologie.
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papaverine, could also be identified. After cloning and heterologous expression of As-DO1-2 and As-ExDO1 in E. coli Rosetta (DE3) pRARE, their activity could be shown for papaverine and two different catechol substrates, respectively. The hydroxylation of the methoxy groups of papaverine by As-DO1-2 represent a possible addition of the postulated degradation pathway in Arthrobacter sp.
For P. immobile strain E (DSM 1986), annotation of the genomic scaffolds identified ORFs for 18 putative RHO α-subunits, of which two ORFs are located on an isolated natural plasmid. In addition, ORFs were found coding only for one RHO β-subunit (DO3), three ferredoxins, two ferredoxin reductases and six extradiol-DOs. Regarding RHOs as a multicomponent enzyme system, this numerical imbalance shows an unusual and complex genetic content of P. immobile strain E. Genes encoding two ferredoxins and one ferredoxin reductase were found to be located along with a dehydrogenase gene within a possible gene cluster. The remaining annotated ORFs are scattered throughout the whole genome, except for DO15, 16, 17, 18, 19, 21 and 31 which are in a clustered arrangement. This arrangement is interrupted by ORFs which encode a Tn3 transposase and a resolvase/invertase. Identical genes of the transposase, resolvase and DO31 were found to be present on the isolated natural plasmid. The presence of such mobile genetic elements within P. immobile strain E show a genetically complex and variable organism. Using proteome analysis, 7 of the 18 annotated RHO α-subunits together with the β-subunit could be identified as potentially involved in the degradation of antipyrine. Cloning and subsequent heterologous expression of a homologous RHO enzyme complex (Pi-DO16-ETC1) in E. coli JM109 (DE3) pRARE2 showed measurable activity for antipyrine as substrate. On the basis of sequence studies this enzyme complex could be classified as RHO system type IVa (according to Kweon et al. 2008).
The type III extradiol-DO 3 and 4 (Pi-ExDO3-4), which are clustered, were detected by proteome analysis and were expressed in E. coli Rosetta (DE3) pRARE. According to the corresponding extradiol-DO from Arthrobacter sp., by using two different catechol substrates the activity of Pi-ExDO3-4 and its potential involvement in the postulated degradation pathway could be shown.
The expansion of the substrate spectrum of a transport protein shown in this work enables the use of additional C-sources. Combined with the newly identified biocatalysts the presented results are a promising starting point for metabolic engineering and synthetic biology and the design of novel metabolic pathways.
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