6 DISKUSSION
6.2 UbcD6 als ein mögliches DNA-Reparaturprotein während des Histon-Protamin-Wechsels
Während des Wechsels von einer auf Histonen basierenden zu einer auf Protaminen basierenden Chromatinstruktur sind parallel zu den DNA-Brüchen, auch große Mengen des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UbcD6 zu detektieren. In den folgenden Stadien sind weder DNA-Brüche, noch UbcD6 zu detektieren (Rathke et al., 2007).
6.2.1 Das Fusionsprotein UbcD6-eGFP ist nicht in den Spermatidenkernen des Kanustadiums zu detektieren
Zunächst sollte die Verteilung des Fusionsproteins UbcD6-eGFP während des Histon-Protamin-Wechsels analysiert werden. Jedoch ist das Protein lediglich in den Flagellen zu detektieren (siehe Kapitel 5.2.1). Eine Anreicherung im Kanustadium, ähnlich des Immunfluoreszenz-Nachweises in Rathke et al. (2007), konnte nicht beobachtet werden.
Da in der Spermatogenese von Drosophila die Translationskontrolle der Testis-spezi-fischen Gene meist über die 5' UTR und den Promotor erfolgt (Hempel et al., 2006), wurde die 3' UTR sowie das Polyadenylierungssignal im Konstrukt UbcD6-eGFP über den Transformationsvektor pChabΔSalΔlacZ bereit gestellt. UbcD6 ist jedoch in der Fliege ubiquitär verteilt und wird auch in anderen Geweben exprimiert. Somit, besteht die Möglich-keit, dass für eine stadienspezifische Expression des Gens im Testis, neben der 5' UTR auch Elemente innerhalb der 3' UTR benötigt werden. Aus diesem Grund wurde ein Konstrukt kloniert, welches den Promotor und die 5' UTR, den vollständigen offenen Leserahmen und die 3' UTR von UbcD6 trägt. Doch auch in Fliegen transgen für dieses Konstrukt, wird das UbcD6-Fusionsprotein lediglich in den Schwanz-Zystzellen exprimiert.
Für humanes RAD6A wurde neben der Funktion im Zellkern auch eine zytoplasmatische Komponente beschrieben (Zenkel et al., 2007). Interessanterweise zeigen zudem neueste in vitro, als auch in vivo Analysen von Haddad et al. (2013), dass das E2 Ubiquitin-konjugierende Enzym RAD6A den Pool an gesunden Mitochondrien erhält. RAD6A und Parkin bilden dabei einen funktionellen E2/E3 Komplex und induzieren die Ubiquitinylierung defekter Mitochondrien (Haddad et al., 2013).
Drosophila defizient für UbcD6 zeigen ebenfalls synaptische Defekte als Konsequenz von fehlerhaften Mitochondrien (Haddad et al., 2013). Somit kann auch die Detektion von
112 DISKUSSION
UbcD6-eGFP in den Flagellen, als Gewebe mitochondrialer Derivate, auf eine Funktion von UbcD6 in Mitochondrien zurückzuführen sein. Dafür spricht, dass auch in der Spermatogenese von Drosophila ein Homolog des Vertebraten Proteins Parkin, dParkin, exprimiert wird und dieses ebenfalls für die Mitochondrien-Morphologie in frühen und späten Spermiogenesephasen benötigt wird (Riparbelli und Callaini, 2007).
Doch sind mit dem Antikörper gegen UbcD6 an wildtypischen Testes zudem starke Färbungen in den Spermatidenkernen des Kanustadiums zu detektieren, welche mit den UbcD6-Fusionsproteinen nicht beobachtet werden können. Dass diese Färbungen jedoch als
„echte“-Signale gewertet werden können, zeigt ein Kompetitionstest des Antikörpers mit einem Peptid, woraufhin der Antikörper keine Färbungen mehr zeigt (Rathke, Dissertation 2007). Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass die Genregulation von UbcD6 über verschiedene Promotoren verläuft und somit auch die Expression in verschiedenen Geweben reguliert wird. Duale Promotoren sind bereits für eine Reihe von Genen bekannt, wie z.B. für antennapedia (Jorgensen und Garber, 1987) und gonadal (Schulz et al., 1990 A, B). Dabei regulieren duale Promotorregionen nicht nur eine räumlich und zeitlich getrennte Aktivierung des Gens, sondern auch die Expression in der männlichen oder in der weiblichen Keimbahn.
Um zu überprüfen, ob auch für die Expression von UbcD6 verschiedene cis-regulatorische Elemente benötigt werden, müsste somit ein weiteres eGFP-Fusionskonstrukt generiert werden, welches einen größeren Bereich stromaufwärts der 5' UTR trägt.
6.2.2 Die Reparatur der DNA-Brüche erfolgt nicht mit Hilfe von Komponenten der Rad6-Postreplikationsreparatur
Eine zentrale Rolle und den physischen Halt im Rad6-Signalweg bilden die Chromatin-assoziierten Ring Finger Proteine Rad18 und Rad5. Rad5 rekrutiert den Ubc13-Mms2 Komplex an die DNA, und durch die Assoziation seinerseits zu Rad18, erfolgt die Bindung an den Rad6-Rad18 Komplex. Die beiden Ring Finger Proteine leiten daraufhin die Bildung eines Komplexes aus Rad6 und Ubc13-Mms2 ein und koordinieren so den Prozess der Ubiquitinylierung in S. cerevisiae (Ulrich und Jentsch, 2000).
Mit Hilfe verschiedener Datenbanken wurden die homologen Drosophila Gene kua, CG7376, CG5524 und CG3473 als Homologe zu den Genen mms2, rad5, rad18 und ubc13 aus Hefe identifiziert (siehe Kapitel 5.2.4). in situ Hybridisierungen zeigen die Transkripte der vier Komponenten im Zytoplasma von Spermatozyten, wobei die Transkripte von CG5524 und CG3473 zudem im Zytoplasma früher Spermatiden zu detektieren sind (siehe Kapitel
113 DISKUSSION
5.2.4). In Stadien mit elongierenden Spermatiden können keine Transkripte mehr detektiert werden und somit scheinen die untersuchten Homologen des PRR-Signalweges in Drosophila auch nicht an der Reparatur von DNA-Strangbrüchen nach dem Wechsel von Histonen zu Protaminen beteiligt zu sein. Nach neuesten Analysen und Datenbankrecherchen wird das Gen CG5524 zudem nicht mehr als mögliches Drosophila Homolog zu rad18 aufgeführt und es kann auch kein weiteres homologes Protein für die E3 Ubiquitin-Ligase Rad18 identifiziert werden. Desweiteren zeigen auch Fliegen transgen für CG3473-eGFP (CG3473 als homologes Gen zu ubc13) eine Expression des Fusionsproteins ausschließlich im Zytoplasma von Spermatozyten (Barckmann et al., unpublizierte Daten). Eine Reparatur der DNA-Brüche über den RAD6-DNA-Reparaturweg erscheint somit noch unwahrscheinlicher.
In der Literatur wird noch eine weitere Funktion von Rad6 im Prozess der Regulierung von DNA-Schäden beschrieben. Dabei bewirkt ein Zusammenspiel aus dem Vertebraten DOT1L (vom engl. disruptor of telomeric silencing 1-like, Homolog zu Dot1 in Hefen) und Rad6 die Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen. Die Monoubiquitinylierung von Histon H2B durch den Proteinkomplex Rad6/Bre1 ist hierbei essenziell für die Trimethylierung von Histon H3K79 durch die Methyltransferase Dot1, welche ihrerseits Bereiche im Chromatin für DNA-Brüche markiert und schließlich diverse DNA-Reparaturproteine rekrutiert (Dover et al., 2002; Schulze et al., 2009). Dabei führt die Dot1-vermittelte H3K79 Methylierung nicht nur zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen, sondern auch zur Reparatur anderer Formen von DNA-Schäden, wie zum Beispiel die Reparatur via Rekombination (RR), der Postreplikationsreparatur (PRR) oder auch der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) (Übersichtsartikel: Nguyen und Zhang, 2011). Dies ist wiederum essenziell für die Reparatur der DNA in der Drosophila Spermiogenese, denn aufgrund der haploiden Situation des Genoms in postmeiotischen Spermatiden, ist eine Reparatur in Abhängigkeit von Schwesternchromatiden, und somit auch über eine homologe Rekombination, nicht möglich.
Interessanterweise wurde erst kürzlich ein homologes Gen zu dot1, das Gen grappa (gpp), in der Spermatogenese von Drosophila beschrieben (Dottermusch-Heidel et al., 2014). Es kodiert ebenfalls für eine Methyltransferase und zeigt eine hohe Sequenz-Identität zu DOT1L in Mammaliern. Immunfluoreszenz-Nachweise zeigen eine Expression der Methyltransferase im Nukleus von Spermatozyten und ein gepunktetes Muster in Spermatidenkernen des Kanustadiums (Dottermusch-Heidel et al., 2014). Die Expression von Gpp überlappt hier mit der Expression von UbcD6 (Rathke et al., 2007) und macht ein Zusammenspiel der Proteine UbcD6 und Gpp in der Regulierung von DNA-Schäden zum Zeitpunkt des Histon-Protamin-Wechsels möglich. Jedoch ist eine Monoubiquitinylierung von H2B durch die E3
114 DISKUSSION
Ubiquitin-Ligase Bre1 nur in der weiblichen Keimbahn beschrieben (Xuan et al., 2013) und auch Bre1 ist in der männlichen Keimbahn nur bis in die meiotischen Stadien zu detektieren (SpermPress: Vibranovski et al., 2009). Es stellt sich die Frage welches Substrat durch UbcD6 ubiquitinyliert wird, und ob dieser Vorgang von einer Ubiquitin-Ligase begleitet wird.
An der Reparatur von DNA-Strangbrüchen zum Zeitpunkt des Histon-Protamin-Wechsels können anstelle von UbcD6 aber auch weitere Enzyme, wie zum Beispiel Ligasen beteiligt sein. Ligasen bilden zwischen der 3'-Hydroxylgruppe und der 5'-Phosphatgruppe der DNA-Fragmente eine Phosphodiesterbindung und besitzen eine Funktion in der DNA-Replikation, wie aber auch in der Reparatur von Einzelstrangbrüchen (Lehman, 1974).
So zeigten beispielsweise Prasad et al. (1996) eine Interaktion der DNA-Polymerase beta und der DNA-Ligase I in der Basenexzisionsreparatur (BER) in Testes von Rindern.
Weiterhin bleibt aber auch zu überprüfen, ob die Reparatur der DNA-Brüche erst nach der Befruchtung erfolgt. Es besteht die Möglichkeit, dass Strangbrüche im Spermium vorhanden sind, jedoch auf Grund des extrem kondensierten Chromatins, mit Hilfe der TUNEL-Reaktion nicht zu detektieren sind. Eine Reparatur dieser Brüche würde demnach erst ist in der Zygote, im Wechsel von Protaminen zu Histonen erfolgen. So konnte bereits gezeigt werden, dass in Spermien von Mäusen chemisch induzierte Strangbrüche in der Zygote über NHEJ repariert werden können (Derijck et al., 2008) und auch in Ratten DNA-Brüche des männlichen Genoms im Vorkern über γH2AX erkannt und dadurch DNA-Reparatur Mechanismen eingeleitet werden können (Grenier et al., 2010).
Da jedoch bisher keine Informationen über einen solchen Mechanismus in Drosophila vorliegen, müssten zunächst jung befruchtete Drosophila Eier auf DNA-Brüche untersucht werden. So wird nach der Befruchtung der paternale Vorkern innerhalb von Minuten in eine Histon-basierende Form überführt (Jayaramaiah-Raja und Renkawitz-Pohl, 2005). Um die Frage zu klären, ob die Reparatur jedoch erst in der Oozyte, vor der Bildung des Zygotenkerns stattfindet, muss erst überprüft werden, ob es in diesem Zeitraum gelingt, den Tunnel-Assay durchzuführen.
115 DISKUSSION