Präparation und Analyse von Proteinen

4.5.1 Proteinextraktion

(NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Kit, Thermo Scientific) Vorbereitung der Zellen

Die Proteinextraktion aus Drosophila SL2-Zellen wird mit Hilfe des NE-PER Kits durchgeführt.

Hierfür werden die transfizierten Zellen zunächst durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in den Wells gelöst und in ein 50 ml-Falcon überführt. Es folgt eine Zentrifugation für 5 Minuten bei 2.000 UpM und 4°C. Der Überstand wird entfernt und das Pellet in 1 ml 1x PBS resuspendiert. Die Zellsuspension wird in ein frisches 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und der Ansatz erneut zentrifugiert (2.000 UpM, 3 Minuten und 4°C). Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 100 µl Puffer CER I und 1 µl 10x Proteinaseinhibitor resuspendiert.

Zytoplasmatische und Nukleäre Protein Extraktion

Der Ansatz wird nun 15 Sekunden auf höchster Stufe gevortext und für 10 Minuten auf Eis inkubiert.

Es wird 5,5 µl eiskalter Puffer CER II zugegeben und 5 Sekunden gevortext. Es folgt eine Zentrifugation für 5 Minuten bei 13.000 UpM und 4°C, woraufhin der klare Überstand (Zytoplasmatische Fraktion) in ein frisches Reaktionsgefäß überführt werden kann. Die Fraktion kann bis zum Gebrauch auf Eis gehalten oder bei -80°C gelagert werden.

Um die nukleären Proteine zu gewinnen, wird das Pellet in 50 µl eiskaltem NER I und 0,5 µl 10x Proteinaseinhibitor resuspendiert, der Ansatz 15 Sekunden auf höchster Stufe gevortext und für 40 Minuten auf Eis inkubiert. Innerhalb der Inkubationszeit wird das Gemisch zudem alle 10 Minuten für 15 Sekunden gevortext. Es folgt ein letzter Zentrifugationsschritt für 10 Minuten bei 13.000 UpM und 4°C. Der Überstand mit dem nukleären Extrakt wird in ein frisches Reaktionsgefäß überführt, im flüssigen Stickstoff schockgefroren und kann bei -80°C gelagert werden.

57 METHODEN

4.5.2 Co-Immunopräzipitation (CoIP)

(GFP-Trap^®_A Kit, Chromotek) 2x SDS-Ladepuffer 120 mM Tris/HCl, pH 6.8

20 % Glycerol 4 % SDS

0.04 % Bromphenolblau 10 % β-Mercaptoethanol

Für die Immunopräzipitation von GFP-Fusionsproteinen wird das GFP-Trap^®_A Kit von Chromotek verwendet. Hierfür werden zunächst die GFP-Trap^®_A Beads equilibriert. Es werden ~30 µl Beads in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und anschließend dreimal mit Verdünnungspuffer gewaschen.

Hierzu werden 500 µl Verdünnungspuffers zugegeben und der Ansatz für 5 Sekunden bei 13.000 UpM und 4°C zentrifugiert. Nach dem letzten Waschschritt wird der Verdünnungspuffer entfernt und die Beads können für die Immunopräzipitation verwendet werden.

Bevor die Kern-Proteinextrakte auf die GFP-Trap^®_A Beads gegeben werden können, werden noch 500 µl Verdünnungspuffer zugegeben, der Ansatz gut durchmischt und pro Ansatz 50 µl in ein neues Reaktionsgefäß als Input (10 %) auf Eis gelagert. Das übrige Gemisch wird nun für die Immunopräzipitation auf die equilibrierten Beads gegeben und der Ansatz 2,5 h auf 4°C und in einem Rotator inkubiert. Die GFP-Proteine binden an die GFP-Trap^®_A Beads und nach der Inkubation kann das überschüssige Material durch eine Zentrifugation für 5 Sekunden bei 13.000 UpM und 4°C entfernt werden. Der Überstand kann als „nicht gebundenes Material“ in ein neuen Reaktionsgefäß überführt werden. Die Beads werden im Anschluss dreimal für 5 Minuten mit 500 µl Verdünnungspuffer gewaschen und anschließend abzentrifugiert (13.000 UpM, 5 Sekunden, 4°C).

Nach dem letzten Waschschritt und der Abnahme des Verdünnungspuffers, werden pro Probe 100 µl 2x SDS-Ladepuffer zugegeben, der Ansatz mit den Beads gut durchmischt und für 10 Minuten auf 95°C aufgekocht, um die Proteinkomplexe von den Beads zu lösen. Anschließend wird noch einmal zentrifugiert (13.000 UpM, 5 Sekunden, 4°C), der Überstand mit den GFP-Fusionsproteinen in ein neues Reaktionsgefäß überführt und auf ein SDS-Gel aufgetragen.

4.5.3 SDS-Gelelektrophorese

(Laemmli, 1970; Bio-Rad)

10x SDS-Page Laufpuffer 25 mM Tris/HCl, pH 8,3

(BIO-RAD) 192 mM Glycin

0,1 %SDS

58 METHODEN

Sammelgel 130 mM Tris/HCl, pH 6,8 Trenngel 380 mM Tris/HCl, pH 8,8

4 % (v/v) Acrylamid 10 % (v/v) Acrylamid

0,1 % (v/v) SDS 0,1 % (v/v) SDS

0,1 % (v/v) APS 0,14 % (v/v) APS

0,1 % (v/v) TEMED 0,1 % (v/v) TEMED

Mit der SDS-Gelelektrophorese werden Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Dabei hilft das im SDS-Ladepuffer enthaltene β-Mercaptoethanol, die Tertiärstrukturen der Proteine und deren mögliche Komplexverbindungen aufzulösen. Desweiteren führt SDS zu einer negativen Ladung der Proteine, sodass beim Anlegen einer elektrischen Spannung die Proteine durch die Polyacrylamid-Matrix zum Pluspol wandern. Die netzartigen Strukturen des Acrylamids führen zudem dazu, dass kleine Proteine schneller als große wandern und die Proteine entsprechend ihrer Größe aufgetrennt werden. Die Porengröße der Matrix nimmt mit steigender Acrylamid-Konzentration ab.

Die einzusetzende Acrylamid-Konzentration richtet sich nach den aufzutrennenden Proteingrößen.

In dieser Arbeit sollen Proteine mit einer Größe von ~50 kDa aufgetrennt werden und so wurde ein 10 %-iges Trenngel gewählt. Die einzelnen Komponenten werden zusammen pipettiert, wobei darauf zu achten ist, dass TEMED und 10 % APS als letztes dazugegeben werden, da diese Komponenten zur Polymerisierung des Gels führen. Nach dem das Trenngel gegossen und auspolymerisiert ist, kann das Sammelgel gegossen werden. Das Sammelgel konzentriert später die Proben in einer Front zum Trenngel und führt somit zu einer gleichmäßigen Trennung.

Nach dem Polymerisieren des SDS-Gels werden pro Spur vorerst 25 µl Proteinextrakt (siehe Kap.

4.5.2 Co-Immunopräzipitation) aufgetragen und zum Größenvergleich der Banden der Massenstandard Color Plus Prestained Ladder (NEB). Für eine bessere Verteilung der Proben in den Taschen des Gels, wird es zunächst für 2-3 Minuten bei 100 V angeschlossen. Anschließend werden die verbleibenden 25 µl Proteinextrakt aufgetragen. Die Gelelektrophorese erfolgt bei 200 V für ~1h, bis die Lauffront aus dem Gel heraus gelaufen ist.

4.5.4 Western Blot Analyse

(Bio-Rad)

10x Tankblot-Puffer 25 mM Tris/HCl, pH 8,3 129 mM Glycin

20 % (v/v) Methanol (Zugabe im 1x Puffer)

10x TBS 20 mM Tris/HCl, pH 7,7 TBSTT 1x TBS

140 mM NaCl 0,05 % Tween20

0,2 % Triton X-100

Färbelösung Methanol 40 % (v/v)

Essigsäure 10 % (v/v)

Coomassie Brillant Blau 0,05 % (w/v)

59 METHODEN

Entfärbelösung Methanol 40 % (v/v)

Essigsäure 10 % (v/v)

Durch die Tauch-Blot-Methode werden Proteine aus einem Polyacrylamidgel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und können anschließend mit proteinspezifischen Antikörpern sowie sekundären Enzym gekoppelten Antikörpern nachgewiesen werden.

Nachdem mit Hilfe der SDS-Gelelektrophorese die Proteine aufgetrennt wurden kann die Gelapparatur abgebaut werden, das Sammelgel entfernt und das Trenngel für 10 Minuten in 1x Tankblot-Puffer auf einem Schwenker gewaschen werden. Anschließend kann der Blot zusammengebaut werden. Hierfür werden zunächst 6 Whatman-Papiere und eine Nitrozellulosemembran auf die Größe des Gels geschnitten. Die 6 Whatman-Papiere wie auch zwei Schwämme werden in Tankblot-Puffer getaucht und die Membran mit dH₂O angefeuchtet. Die Blotapparatur wird nach folgendem Schema zusammen gebaut, und über Nacht bei 4°C und 30 V durchgeführt.

- Pol Schwamm

3 Whatman-Papiere Gel

Nitrozellulosemembran 3 Whatman-Papiere + Pol Schwamm

Am nächsten Tag wird die Apparatur abgebaut und die Membran für 10 Minuten in 1x TBS gewaschen. Um die Effizienz des Transfers zu überprüfen, wird das Trenngel mit Coomassie gefärbt und anschließend in Entfärbelösung geschwenkt, bis deutliche Protein-Banden zu erkennen sind.

Um unspezifische Bindestellen auf der Membran abzusättigen, wird die Membran für ca. eine Stunde in 5 % Milchpulver in TBS geschenkt. Anschließend wird die Nitrozellulosemembran mit dem Erstantikörper (verdünnt in 5 % Milchpulver in TBS) über Nacht und bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag folgen zwei Waschschritte mit TBSTT und ein Waschschritt mit TBS für je 10 Minuten, woraufhin die Membran für eine Stunde bei RT mit dem Peroxidase-gekoppelten Zweitantikörper inkubiert werden kann. Dieser wird ebenfalls in 5 % Milchpulver in TBS verdünnt. Nach der Inkubation folgen 4 Waschschritte in TBSTT für je 10 Minuten.

Für die anschließende ECL-Reaktion wird das Novex^® ECL Chemiluminescent Substrate Reagent Kit von Invitrogen verwand. Die beiden im Kit enthaltenen Reagenzien A (Luminol) und B (Enhancer) werden vermischt und 1 ml für eine Minute des Gemisches auf die Nitrozellulosemembran gegeben. Die an den sekundären Antikörper gekoppelte Peroxidase katalysiert eine Chemolumineszenzreaktion des Reagenziengemisches, die mit einem Chemilumineszenz-sensitivem Films sichtbar gemacht wird.

60 METHODEN