TSPY-LTA transgene Mäuse

Im Rahmen des in vivo Ansatzes sollten transgene Mäuse generiert werden, die das LTA sta-dienspezifisch in den Spermatogonien exprimieren. Untersucht werden sollte, ob Spermato-gonien die Potenz zur malignen Transformation besitzen. Zu diesem Zweck wurde das SV40 large T Antigen an eine 1.3 kb lange 5’-flankierende Sequenz des humanen TSPY-Gens (te-stis-specific protein, Y-encoded) gekoppelt. Die Aktivität dieser TSPY-Promotorregion wurde zuvor unter Verwendung eines CAT-Reportergens in verschiedenen Zellinien ausgetestet (III.

4.5). Das TSPY-Gen ist beim Menschen auf dem Y-Chromosom lokalisiert und wird

aus-3.1 Herstellung eines TSPY-LTA Konstruktes

Eine 1.3 kb große 5’-flankierende Sequenz des humanen TSPY-Gens wurde aus dem Plasmid TSPY-pCR3-Uni mit NotI herausgeschnitten. Parallel wurde das LT-Blue Plasmid, welches das LTA enthält, mit NotI linearisiert. Die TSPY-Promotorregion wurde anschließend isoliert und in das NotI linearisierte LT-Blue-Plasmid ligiert (Abb. 16). Um die korrekte Orientie-rung zu überprüfen, wurde das Konstrukt TSPY-LTA-LT-Blue sequenziert. Anschließend

urde es für die Mikroinjektion vorbereitet. Die 1.3 kb lange 5’-flankierende Sequenz des schließlich im Testis exprimiert. Antikörperfärbungen an Testisschnitten zeigen eine spezifi-sche Expression von TSPY in Spermatogonien (Schnieders et al., 1996).

w

TSPY-Gens wurde freundlicherweise von Prof. Dr. J. Schmidtke, Institut für Humangenetik Hannover, zur Verfügung gestellt.

as zuvor mit NotI linearisierte LT-Blue-Plasmid ligiert.

.2 Erzeugung transgener TSPY-LTA Mäuse

Die Erzeugung transgener TSPY-LTA Mäuse wurde am Max-Plack-Institut für Molekulare Medizin, Göttingen, durchgeführt. Das oben beschriebene Konstrukt TSPY-LTA wurde in den männlichen Vorkern befruchteter Oozyten injiziert. Die mikroinjizierten Oozyten wurden anschließend in die Eileiter scheinschwangerer Mäuse retransferiert. Insgesamt wurden 105 Nachkommen geboren. Diese wurden im Alter von 21 Tagen auf Transgenität untersucht.

Abb. 16 Schematische Darstellung der Klonierungsstrategie zur Herstellung des TSPY-LTA (TSPY-LTA-LT-Blue) Konstruktes. Die 1.3 kb große 5’-flankierende Sequenz des humanen TSPY-Gens wurde mit NotI aus dem Plasmid TSPY-pCR3-Uni isoliert. Parallel wurde das LT-Blue-Plasmid mit NotI geschnitten. Anschließend wur-de die isolierte TSPY-Promotorregion in d

3

Dafür wurden PCR- und Southern Blot-Experimente durchgeführt. Insgesamt konnten 5 Foundertiere (Foundertier Nr. 23, Nr. 39, Nr. 41, Nr. 57 und Nr. 61) über PCR- und Southern Blot-Analysen als transgen identifiziert werden (Abb. 17). Die positiven Foundertiere wurden im Alter von 56 Tagen mit Wildtypmäusen des Stammes FVB verpaart. Die Nachkommen wurden auf Transgenität analysiert und mit heterozygoten F1-Tieren verpaart, um homozygo-te Linien aufzubauen.

Abb. 17 Southern Blot-Analyse der identifizierten Foundertiere. Je 20 µg isolierte genomische DNA aus Schwanzbiopsien wurde mit EcoRI restringiert und im Southern Blot mit einer LTA-spezifischen cDNA Sonde hybridisiert. Alle Foundertiere zeigten das charakteristische Hybridisierungssignal von LTA bei 2.7 kb.

.3 Analyse der F1-Generation

aus konnte bei der Linie 23 eine Expression von LTA über RT-PCR nachgewiesen werden II. 3.4). Das Foundertier dieser Linie starb im Alter von 3 Monaten an ungeklärter Ursache.

ei der Linie 39 konnten keine transgenen Nachkommen identifiziert werden, was darauf n nicht in die Keimbahn aufgenommen hat. Der weibliche Founder 41 zeichnete sich durch einen sogenannten „Drehwurm“ aus. Da-bei weist das Tier motorische Störungen auf. Dieses Syndrom tritt Da-bei Mäusen des Stammes FVB relativ häufig auf und ist unabhängig von der Transgenität des Tieres. Bei dieser Linie wurden keine Nachkommen geboren. Der weibliche Founder 57 ist bis zum Alter von 118 Tagen nicht trächtig geworden. Danach setzten bei diesem Tier starke äußerliche Verände-rungen ein. Das Tier zeigte extrem starke GleichgewichtsstöVerände-rungen, allgemein schlechtes und 3

Bei der Linie 23 wurden transgene Nachkommen in der F1-Generation geboren. Darüber hin-(I

B

hindeutet, dass der weibliche Founder 39 das Transge

krankhaftes Aussehen sowie Reflexstörungen und allgemeine Schwäche. Von diesem Tier wurden keine Nachkommen geboren. Bei der Linie 61 wurden transgene Nachkommen in der F1-Generation geboren. Außerdem konnte auch bei dieser Linie eine Expression von LTA nachgewiesen werden (III. 3.4).

3.4 Expressionsanalyse für LTA

Von jeweils einer männlichen hemizygoten transgenen Maus der Linie 23 und der Linie 61 wurden die Testes im adulten Alter präpariert und Gesamt-RNA isoliert. Jeweils 2 µg Ge-samt-RNA wurden unter Verwendung genspezifischer Primer für LTA (LTA-F und LTA-R1) in einer RT-PCR Reaktion eingesetzt. Bei beiden Linien konnte eine Expression von LTA im Testis nachgewiesen werden (Abb. 18A). Darüber hinaus wurde von einer 25 Tage alten he-mizygoten männlichen Maus der Linie 23 Gesamt-RNA aus den Organen Herz, Leber Niere, Testis, Lunge, Milz und Gehirn isoliert. Jeweils 2 µg Gesamt-RNA wurden unter Verwen-dung genspezifischer Primer für LTA (LTA-F und LTA-R1) in einer RT-PCR Reaktion ein-gesetzt. Dabei zeigte sich neben der Expression von LTA im Testis auch eine Expression in der Milz (Abb. 18B). Zur Überprüfung der Integrität der RNA wurde eine RT-PCR mit spezi-fischen Primern für ß-Actin durchgeführt.

Abb. 18 (A). Hemizygote adulte transgene Mäuse der Linien 23 und 61 wurden auf eine LTA-Expression im Testis überprüft. RT-PCR-Analysen unter Verwendung von genspezifischen Primern für LTA detektierten das

3.5 Ausbildung von Tumoren bei den TSPY-LTA transgenen Mäusen

tnatal im Alter von 3-4 Monaten letal aus-wirkt. Bei der Linie 23 zeigten insgesamt 4 männliche und 3 weibliche hemizygote Mäuse

nd bei der Linie 57 zeigte das weibliche Foundertier im Alter von 3-4 Monaten ausgeprägte Gleichgewichtsstörungen, Reflexstörungen und Abmagerung. Charakteristisch war weiterhin, dass sich bei sämtlichen Tieren im fortgeschrittenen Krankheitsstadium eine Augenaffektion fand. Insgesamt waren fünf transgene Mäuse in zwei unabhängigen Linien (Linie 23 und Li-nie 57) betroffen, die diese Symptome aufwiesen. Die Tiere wurden kurz vor dem absehbaren Tode abgetötet und die Gewebe fixiert. Nach dem Öffnen der Schädeldecke und dem umsich-tigen Ausheben des Gehirns, zeigte sich bei allen Tieren eine Tumormasse in der Sella turcica (Abb. 19A-C). Diese Tumoren werden derzeit in Zusammenarbeit mit Dr. Schulz-Schaeffer, Abt. Neuropathologie, Universitätsklinikum Göttingen, weiterführend charakterisiert.

Tumo-n im Testis oder aTumo-ndereTumo-n OrgaTumo-neTumo-n koTumo-nTumo-nteTumo-n Tumo-nicht gefuTumo-ndeTumo-n werdeTumo-n.

LTA-Fragment von 329 bp in testikulärer RNA der Linie 23 und der Linie 61. Zum Nachweis der Integrität der RNA wurde eine RT-PCR mit genspezifischen Primern für ß-Actin durchgeführt. (B) RT-PCR-Analyse an iso-lierter Gesamt-RNA aus verschiedenen Organen einer 25 Tage alten hemizygoten TSPY-LTA transgenen Maus (Linie 23). Das spezifische LTA-Fragment von 329 bp konnte im Testis und in der Milz detektiert werden. Zum Nachweis der Integrität der RNA wurde eine RT-PCR mit genspezifischen Primern für ß-Actin durchgeführt.

Bei den TSPY-LTA transgenen Mäusen besteht die Möglichkeit, dass sich die Expression des LTA unter der Kontrolle des TSPY-Promotors pos

u

re

Abb. 19 (A) Bei den transgenen Mäusen bildeten sich Tumoren in der Sella turcica. Nach dem umsichtigen Entfernen des Gehirns konnte dort ein Tumor isoliert werden. Deutlich erkennbar ist der Ascites, eine Hypophy-senstruktur war nicht mehr zu erkennen. (B) Darstellung der Hypophyse einer normalen Wildtypmaus. (C) Dar-stellung eines Hämatoxilin-Eosin-gefärbten Tumors mit anliegendem Hirngewebe. Der Tumor wurde aus einer transgenen TSPY-LTA Maus isoliert (200fache Endvergrößerung).