Histologische Techniken

11.1 Herstellung von Paraffinschnitten aus Geweben und Organen

Das frisch präparierte Material wurde direkt in das entsprechende Fixativ gegeben und je nach Größe des Präparats für eine Stunde bis zu einer Woche bei RT fixiert. Mit Hilfe einer auf-steigenden Alkoholreihe (50%, 70%, 90% und 96%) wurde das Gewebe entwässert. Um den Ethanol vor der Einbettung in das Paraffin vollständig zu entfernen, wurde das Gewebe über Nacht in Methylbenzoat inkubiert. Für die Einbettung wurde das Paraffin im Wasserbad bei 58°C geschmolzen. Die Einbettung bestand aus mehreren Schritten, die sämtlich bei 58°C durchgeführt wurden. Für die Entfernung des Methylbenzoats wurde das Gewebe zweimal mit Benzol und zweimal in einem 1:1 Benzol/Paraffin-Gemisch jeweils für 1 h inkubiert. Zur vollständigen Durchdringung des Gewebes mit dem Paraffin wurde das Präparat anschließend zweimal für 1 h in Paraffin inkubiert. Im Anschluss daran wurde die auf 58°C temperierte Einbettungsform etwa zur Hälfte mit geschmolzenem Paraffin gefüllt, das Gewebe in die Form überführt und mit Paraffin aufgefüllt. Nach der Aushärtung über Nacht wurde der Paraf-finblock aus der Form genommen und bei 4°C gelagert. Die Paraffinblöcke mit dem fixierten Material wurden zu Quadern optimaler Größe zurechtgeschnitten und in das Mikrotom (Hn 40 Ing., Nussloch) eingespannt. Die Schnittdicke betrug 5–8 µm. Mit Hilfe eines feinen Pin-sels wurden die Schnitte auf die vorbehandelten Objektträger übertragen. Um eine bessere Haftung der Schnitte zu erreichen, wurden die Objektträger mit einem Tropfen 70%igem E-thanol benetzt und diese auf einer 40°C warmen Heizplatte erwärmt. Die Schnitte wurden di-rekt auf den Ethanoltropfen aufgelegt und solange auf der Wärmeplatte inkubiert, bis das E-thanol vollständig verdampft war. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Schnitte licht geschützt bei 4°C gelagert.

11.2 Hämalaun-Eosin Färbung von Testisschnitten

Für die mikroskopische Untersuchung wurden die Testisschnitte mit Hämalaun-Eosin gefärbt.

Die Zellkerne färben sich hierbei blau. Alle anderen Zellstrukturen werden durch Eosin röt-lich gefärbt. Die Schnitte wurden zunächst für 2 x 10 min in Xylol-Ersatz entparaffiniert und

anschließend durch eine absteigende Alkoholreihe für jeweils 2 min rehydriert. Die Färbung erfolgte zunächst für 5-10 min in Hämalaun. Anschließend wurde gründlich mit H2O gespült und 5-10 min mit Eosin-Färbelösung (Eosin-Stammlösung 1:10 in H2O verdünnt) gegenge-färbt. Die Schnitte wurden in H2O gespült, dehydriert (50%, 70%, 90%, 100%) und naß mit Eukit eingedeckt.

11.3 Keimzellseparation (Romrell et al., 1976)

Die Testes wurden entnommen und kurz in 1 x PBS-Puffer gewaschen. Die Tunica albuginea wurde entfernt und der Inhalt der Testes in 120 ml Collagenase-Lösung bei 33°C für 30 min inkubiert. Die Tubuli seminiferi wurden durch Zentrifugation (10 min, 200 g, 4°C) pelletiert und zweimal in 50 –75 ml EKRB-Puffer gewaschen. Nach Entfernen des Überstandes wurden die Tubuli 15 min in 60 ml Trypsin/DNase-Lösung bei 33°C inkubiert. Nach einer anschlie-ßenden Zentrifugation wurden die Tubuli zunächst in 60 ml kalter 0.5%iger BSA-Lösung gewaschen und dann in 30 ml kalter BSA/DNase-Lösung aufgenommen. Zur Entfernung von Geweberesten wurde die Suspension durch eine sterile Gaze filtriert und mit kalter 0.5%iger BSA-Lösung auf ein Endvolumen von 100 ml aufgefüllt. Von dieser Suspension wurde 1 ml für die mikroskopische Analyse entnommen. Die Separation der Keimzellen erfolgte nach dem Prinzip der gravitationsabhängigen Sedimentation in einem BSA-Gradienten in einer Zellseparationskammer (Celsep^TM, Depart Inc. Washington, Delaware, USA). Der BSA-Gradient wurde in der Kammer im Kühlraum bei 4°C wie folgt vorbereitet: Über einen Gra-dientenmischer wurde in der Kammer in schräger Position (30°) mit Hilfe einer Peristaltik-pumpe (20 ml/min) ein Gradient aus je 450 ml 2%- und 4%-iger BSA-Lösung gemischt. Der Gradient wurde, bis die Kammer vollständig gefüllt war, mit 200 ml 10%iger BSA-Lösung unterschichtet. Durch Abpumpen des 10%igen Gradientenkissens wurde die Zellsus-pension auf den BSA-Gradienten gesogen und die Kammer in die horizontale Stellung abge-senkt. Die Sedimentation wurde nach 90 min gestoppt und die Kammer in die 30° Position zurückgebracht. Durch Abpumpen wurden 50 ml Fraktionen gesammelt, von denen je 1 ml in einer 24-Loch Minikulturplatte (Greiner, Nürtingen) mikroskopisch beurteilt wurde. Die Fraktionen mit angereicherten Pachytänspermatozyten, runden Spermatiden und elongierten Spermatiden wurden bestimmt, die Zellen dieser Fraktionen pelletiert (10 min, 200 x g, 4°C).

Die Zellen gleichen Typs wurden in 200 µl 1 x PBS vereinigt und bei –70°C eingefroren.

11.4 Immunlokalisierung von Proteinen in Paraffinschnitten

Deparaffinierte Schnitte wurden 5 min in PBS/ 1% Triton X-100 permeabilisiert. Die Präpara-te wurden 2 x 5 min in PBS gewaschen und die überschüssige Flüssigkeit abgesaugt. Unspe-zifische Bindungsstellen wurden 30 min mit 50–100 µl 5% Ziegen-Normalserum in PBT ab-gesättigt. Danach wurde erneut überschüssige Flüssigkeit mit einem Filterpapier abgesaugt.

Auf das Präparat wurden 10 µl der monospezifischen Antikörperlösung (2 µg/ml) gegeben und mit einem Deckglas luftblasenfrei bedeckt. Die Schnitte wurden 2 h in einer feuchten Kammer mit PBS als Puffer inkubiert. Unspezifische Antikörper-Bindungen wurden in PBT 4 x 10 min abgewaschen. Der Zweitantikörper (Ziege-α-Kaninchen-alkalische Phosphatase) wurde 1:500 in PBT verdünnt. Pro Objektträger wurden 50–100 µl Antikörperlösung einge-setzt. Nach 2 h Inkubation in einer feuchten Kammer wurden nicht gebundene Antikörper 4 x 10 min in PBT ausgewaschen. Das Gewebe wurde in Puffer 3 für 2 min umgepuffert, bevor 50 µl Färbelösung auf den Schnitt gegeben wurden. Die Farbreaktion erfolgte unter einem Deckglas und wurde regelmäßig unter dem Mikroskop kontrolliert. Durch Eintauchen der Ob-jektträger in TE-Puffer wurde die Reaktion gestoppt. Danach wurden die Präparate in H2O kurz gewaschen und mit einem Tropfen Aqua-Polymount eingedeckelt.

11.5 In-Situ End-Labelling (ISEL) (Wijsman et al., 1993)

Beim Prozess der Apoptose kommt es zu charakteristischen Strangabrüchen. Bei der ISEL-Methode macht man sich diese Tatsache zunutze, indem man biotinilierte Nukleotide in situ in die DNA-Strangbrüche durch eine DNA-Polymerase inkorporiert. Die eingebauten Nukleo-tide werden hieran immunhistochemisch gefärbt.

ISEL wurde an Testisschnitten der PGK2-LTA transgenen Mäuse angewendet. Dabei wurden Paraffin-Testischnitte von homozygoten transgenen als auch von nichttransgenen Mäusen angefertigt (II.11.1). Nach erfolgter Deparaffinisierung wurden die Schnitte histologisch mit Hämatoxilin und Eosin angefärbt (II.11.2). Danach erfolgte eine Inkubation der Schnitte mit Proteinase K (0.7 U/ml, gelöst in TBS) (Sigma, Deisenhofen) für eine Stunde bei 37 °C. Die Testisschnitte wurden mit TBS gespült und anschließend in 50 µl labelling mix (250 U/ml terminale Transferase, 20 µl/ml DIG-DNA-labelling mix und 1 mmol/l CaCl in

Reaktions-puffer für terminale Transferase) (Roche, Mannheim) für eine Stunde bei 37°C inkubiert.

Nach einem Waschschritt mit TBS-Puffer wurden die Testisschnitte mit 10%igem fetalem Kälberserum (Roche) für 15 min geblockt. Anschließend wurden die Schnitte für 60 min mit einem alkalischer Phosphatase-konjugierten Antikörper gegen Digoxigenin (Roche) in einer Verdünnung von 1:250 inkubiert. Für die Detektion wurde 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat als Substrat hinzugegeben. Als Positivkontrollen wurden humane Lymph-knoten mit reaktiven folikulären Hyperplasia verwendet. Die Durchführung der ISEL-Experimente erfolgte in Zusammenarbeit mit Dr. Schweyer, Abt. Pathologie, Universitätskli-nikum Göttingen.

11.6 Quantifizierung von Spermatozyten, Spermatiden und Sertoli-Zellen

Spermatozyten, Spermatiden und Sertoli-Zellen wurden von den PGK2-LTA transgenen Mäusen in verschiedenen Altersstadien quantifiziert. Dabei wurden die Testes der transgenen und nichttransgenen Mäuse entnommen und in Bouin’scher Lösung fixiert (II.11.1). Nach ca.

48 h wurden die Testes in Paraffin eingelegt und histologische Schnitte auf Objektträgern an-gefertigt. Diese wurden einer Hämatoxilin- und Eosin-Färbung ausgesetzt (II.11.2). Die Aus-zählung der Zellen erfolgte unter einem Leica DMRE Mikroskop bei konstanter Vergröße-rung. Für die Quantifizierung der Spermatozyten wurden die zu analysierenden Tubuli nach dem Zufallsprinzip ausgezählt. Bei den Spermatiden wurden die elongierenden Spermatiden in Tubuli des Stadiums VI der Spermatogenese gezählt. Für die Quantifizierung der Sperma-tozyten und der elongierenden Spermatiden wurde ein Minimum von 8000-10 000 Zellen ge-zählt. Sertoli Zellen wurden nach einer immunhistochemischen Färbung (II.11.4) mit einem anti-Vimentin Antikörper (Santa Cruz, Heidelberg) abgeschätzt. Die statistische Auswertung der Daten erfolgte über einen Student’s-T-Test. Eine Zufallswahrscheinlichkeit von p < 0.05 wurde angenommen. Die Experimente wurden in Zusammenarbeit mit Priv. Doz. Dr. A.

Meinhardt, Institut für Anatomie und Zellbiologie, Universität Marburg durchgeführt.

III. Ergebnisse