Transkriptionsanalysen von C. albicans SC5314 mittels gesamt-

2.13.1 Inkubation mit Wirkstoff und Probenahme

Um den Einfluss von EMC120B12 und Fluconazol auf C. albicans weiter aufzuklären, wurden ausgewählten Candida-Stämmen mit den Substanzen inkubiert und anschließend die Proben für eine Microarray-Analyse aufgearbeitet. Als Erstes wurden Übernacht-Kulturen der ausgewählten Candida-Stämme angeimpft. Die Kulturen wurden am nächsten Morgen in 150 ml YPD-Medium überimpft und in bis zur exponentiellen Wachstumsphase, entsprechend einer OD von etwa 0,8, bei 30 °C inkubiert. In Erlenmeyerkolben wurden je Ansatz 100 ml mit 10 % FCS supplementiertes RPMI 1640 vorbereitet. EMC120B12 oder Fluconazol wurde in den entsprechenden Endkonzentrationen (IC50) in das Medium zugegeben. Die Kontrollen blieben unbehandelt.

Alle Ansätze wurden mit der exponentiellen Candida-Kultur so angeimpft, dass die OD zum Start der weiteren Inkubation 0,4 betrug. Es wurde für 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss wurden die Kulturen für 3 Minuten bei 1200 x g für 3 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellpellets wurden vorsichtig im restlichen Medium resuspendiert. Mit einer Pipette wurden die Proben tropfenweise in mit flüssigem Stickstoff gefüllte 50 ml Falcons gegeben. Die so entstandenen kleinen Zellperlen wurden bis zur RNA-Isolierung bei -80 °C gelagert.

2.13.2 RNA-Isolierung

Der Aufschluss der Candida-Zellen erfolgte mechanisch mit einer Retschmühle (Retsch, Haan, Deutschland). Die Behälter der Retschmühle und alle anderen Gegenstände wurden mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt. Um ein Auftauen der Proben zu Vermeiden wurde während des Zellaufschlusses gegebenenfalls flüssiger Stickstoff zugegeben. Die Frequenz des Aufschlusses betrug 30 Hz für 2 Minuten. Bei Bedarf wurde die Prozedur wiederholt, bis die Zellperlen vollständig zu feinem Pulver zerrieben waren. Das Pulver wurde daraufhin unverzüglich in 15 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben, in denen bereits 4 ml RLT-Puffer (RNeasy Midi Kit) mit 40 μl ß-Mercaptoethanol vorgelegt waren. Alle hierbei eingesetzten Geräte und Materialien wurden zuvor in Natriumhypochloridlösung eingelegt, gründlich abgespült und mit 70 %igem Ethanol gereinigt.

Die RNA wurde unter Verwendung des RNeasy Midi Kits von Qiagen aufgereinigt.

Dabei wurde nach dem Protokoll „Purification of total RNA from yeast“ gearbeitet und die Prozedur für „Mechanical disruption of cells“ befolgt. Ein DNase-Verdau erfolgte auf den Säulchen mit dem RNase-free DNase-Set von Qiagen (Hilden, Germany). Die isolierte RNA wurde mit einer Lithiumchlorid-Lösung gefällt. Hierzu wurden 500 µl 4 M LiCl-Lösung zu 500 µl RNA-Probe gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die RNA wurde anschließend dreimal mit 70 % Ethanol gewaschen und das RNA-Pellet bei 37 °C für 5 Minuten getrocknet. Danach wurde die RNA in 50 µl RNase-freies ddH2O aufgenommen.

2.13.3 RNA-Konzentrationsbestimmung

Die Qualitätskontrolle und Konzentrationsbestimmung der RNA erfolgte mittels einer Kapillar-Gelelektrophorese im Agilent 2100 Bioanalyzer. Es wurden RNA Nano 6000-Chips eingesetzt und nach dem Protokoll des Herstellers vorgegangen. Die RNA-Proben wurden zuvor jeweils 1:10 mit RNAse-freiem ddH2O verdünnt und davon 1 μl für die Analyse eingesetzt.

2.13.4 Reverse Transkription und Labeling der Proben

25 µg der isolierten RNA wurden für die Reverse Transkription in cDNA und für das Labeling eingesetzt. Das maximale einsetzbare Volumen der RNA betrug 19 µl.

Die Reverse Transkription und das Labeling wurden mit dem LabelStar-Kit von Qiagen (Hilden, Germany) durchgeführt. Die Markierung erfolgte dabei mit Cy3-dCTPs oder Cy5-dCTPs. Alle Reaktionen wurden auf Eis und genau nach Protokoll des Kits durchgeführt.

Nach der Reversen Transkription wurden die Cy3- beziehungsweise Cy5-markierten Proben und die Referenz vereinigt, aufgereinigt und mit 30 µl Elution buffer des Kits eluiert. Bei Cy3-markierten Proben war die Referenz entsprechend mit Cy5 markiert.

Ebenso war die Referenz einer Cy5-markierten Probe mit Cy3 markiert.

2.13.5 Drucken und Blocken der DNA-Microarrays

Die gesamt-genomischen C. albicans-DNA-Microarrays wurden auf Epoxy-Slides (Schott Nexterion, Jena, Deutschland) mit dem Microgrid II robot von Biorobotics (DigiLab Inc., Holliston, USA) gedruckt. Es wurden 6400 Oligonukleotide (55-70 mer), gelöst in Spotting Puffer (3 x SSC, 1.5 M Betaine) im Duplikat verwendet. Zudem

wurden 10 Bakteriophagen Lambda-Oligonukleotide als DNA spezifische Kontrolle auf die Slides aufgebracht.

Die Oligonukleotide (Operon Biotechnologies Custom Array-Ready Longmers, Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Deutschland) zeigten weniger als 70 % Kreuzhybridisierung mit den Daten folgender Sequenzen: Humane Genomsequenz (BLAST Datenquelle: C. albicans Assembly 21, www.candidagenome.org und Ensembl Human Transcripts www.ensembl.org). Die Oligonukleotide wurden mit SMP3 Pins (Arrayit Corporation, Sunnyvale, CA) auf die Slides gespottet. Im Anschluss wurden die Sonden, der in dieser Arbeit verwendeten Epoxy-Slides, auf der Oberfläche der Slides immobilisiert. Dazu wurden die Slides zunächst für 30 Minuten in einer Feuchtigkeitskammer (> 80 % Luftfeuchtigkeit) gelagert und anschließend bei 80 °C für 120 Minuten gebacken (Cabinet Dryer, Memmert GmbH). Die DNA-Arrays wurden bis zur Verwendung im Exsikkator unter Argon-Atmosphäre gelagert. Um unspezifische Bindungen zu vermeiden wurden die Mikroarrays vor der Hybridisierung wie folgt bei Raumtemperatur geblockt:

Schritt Dauer

0,1 % Triton-X-100 5 Minuten

1 mM HCl 4 Minuten

100 mM KCl 10 Minuten

ddH2O 1 Minute

Blocking Solution 15 Minuten

ddH2O 1 Minute

Die Blocking Solution (1x Nexterion Blocking Solution, Schott, Jena, Germany) wurde zuvor im Wasserbad auf 65 °C erwärmt. Nach dem letzten Schritt wurden die Slides durch Zentrifugation (10000 x g, 3 Minuten) getrocknet und bis zur Hybridisierung im Dunkeln gelagert.

2.13.6 Hybridisierung und Scannen der DNA-Microarrays

Alle Versuche erfolgten in drei biologischen Replikaten. Zudem wurden die Proben als dye swaps (Vertauschen der Marker) durchgeführt. Es wurden die Proben nach Behandlung mit EMC120B12, Nocodazol und Fluconazol sowie eine unbehandelte Kontrolle wie im Folgenden beschrieben hybridisiert.

Hybridisierungs-Ansatz:

30 µl cDNA Eluat 6,5 µl SDS (1 %) 13 µl 20 x SSC

15,5 µl RNase-freies ddH2O

Die Ansätze wurden bei 100 °C für 3 Minuten denaturiert. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht für 16 – 20 Stunden bei 65 °C. Dazu wurden LifterSlips Hybridisierung-Deckgläser (25 x 44 mm, VWR, Darmstadt, Deutschland) verwendet. Im Anschluss an die Hybridisierung wurden die LifterSlips entfernt und die Arrays wie folgt gewaschen:

2x SSC, 0,2 % SDS für 1 Minute (Entfernung der LifterSlips) 2 x SSC, 0,2 % SDS für 10 Minuten

2 x SSC für 10 Minuten 0,2 x SSC für 10 Minuten

Danach wurden die DNA-Microarrays durch Zentrifugation (10000 x g, 3 Minuten) getrocknet bis zum Scannen im Dunkeln gelagert. Die Slides wurden im Genepix Microarray-Scanner 4300A (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gescannt (Auflösung 10 µm; PMT Einstellung: Auto-PMT). Die Bilder beider Kanäle wurden als 16-bit TIFF Datei gespeichert.

2.13.7 Datenanalyse der DNA-Microarrays

Zur Datenanalyse wurde ein gal-file entwickelt. Dazu wurde die TAS Application Suite software Version 2.7.1.18 von Genomic Solutions (Huntingdon, UK) verwendet. Zum Scannen der Slides wurde die GenePix Pro-Software Version 7.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) eingesetzt. Die Rohdaten wurden mittels der Software R (V. 2.10.1), dem Limma-Paket (V. 3.2.1) und dem statmod-Paket (V. 1.4.2) ausgewertet (Limma:

Smyth GK. 2005, R:. R: A language and environment for statistical computing. 2009).

Zur weiteren Verarbeitung der Daten wurde die empirische Bayes-Methode und Smyth’s empirische Bayes-Ansatz verwendet. Es wurde wie in Keller et al., 2015 beschrieben vorgegangen. Diese Methoden wurden eingesetzt, um Informationen über die Gene zu erhalten und die Analyse auch mit einer kleinen Anzahl von Arrays

pro Experiment stabil zu halten (Smyth, 2005; Smyth, 2004; Smyth et al., 2005). Die Korrektur des Hintergrunds wurde mit normexp (normal exponential model) mit einem Offset von 50 durchgeführt (Ritchie et al., 2007). Die Daten wurden wie unter Smyth und Speed, 2003 beschrieben normalisiert. Spots, die bei der Bildauswertung als nicht gefunden galten, wurden im Weiteren ignoriert. Es wurde zudem ein multipler Hypothesen-Test durchgeführt. Hierzu wurde nach der Methode von Benjamini und Hochberg vorgegangen (Benjamini und Hochberg, 1995). Der Quotient zwischen erwarteten falsch-positiven Genen und allen differenziell exprimierten Genen erlaubt es einen angepassten P-Wert (adjusted P value) zu berechnen. Dieser kann für Prognosen über die differentielle Gen-Expression verwendet werden. Gene wurden als differentiell exprimiert betrachtet, wenn der adjusted P value bei 0,05 lag, was mindestens einer 2-fachen Hoch- oder Runterregulierung der Gene entsprach. Die Microarray-Daten dieser Arbeit sind unter NCBI’s Gene Expression Omnibus (GEO;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) hinterlegt. Die GEO Zugangsnummer ist die GSE64976.