Hypothese II: Die PSC begünstigt die Entstehung einer Kolitis durch die Änderung des Mikrobioms, die durch eine Änderung der Gallensäurezusammensetzung vermittelt wird. Um
3 Ergebnisse
3.1 Einfluss einer Kolitis auf die Entstehung einer Leberpathologie
3.1.2 Transferkolitis in Rag1 -/- Mäusen
DSS-Kolitis deutlicher ausgeprägt. Hinweise auf eine vermehrte Fibrosierung der Lebern der behandelten Tiere bestanden zumindest bei den akut behandelten Tieren nicht.
Abbildung 8: Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen in der Leber am Ende einer chronischen DSS-Kolitis in Wildtyp Mäusen. Den Tieren wurde in insgesamt drei Zyklen 2,5 % DSS ad libitium im Trinkwasser verabreicht, zwischen den Zyklen erhielten sie autoklaviertes Leitungswasser. Dargestellt ist der arithmetische Mittelwert und der SEM von jeweils neun Tieren je Versuchsgruppe. Die Genexpression wurde jeweils auf das Haushaltsgen Hprt normalisiert. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Mann-Whitney T-Test. **: p ≤ 0,01; ***: p ≤ 0,001. a) Expression von Il6 und Tnfa in der Leber; b) Expression von Cxcl1 und Ccl25 in der Leber; c) Expression von Ifng in der Leber.
Zellsortierung. Im Anschluss wurden jeweils 1*105 Zellen je Rag1-/- Maus mittels i.p.
Injektion injiziert. Die Tiere wurden regelmäßig endoskopiert und gewogen. Die zelluläre Analyse erfolgte zum Zeitpunkt der höchsten Entzündungsaktivität im Dickdarm.
Abbildung 9: Klinische Parameter einer T-Zell-abhängigen Kolitis in Rag1-/ Mäusen. TH0, TH1 und TH17 Zellen wurden in vitro differenzierte und jeweils 105 Zellen sowie PBS als unbehandelte Kontrolle in Rag1-/ - Mäusen mittels i.p. Injektion transferiert. In jeder Versuchsgruppe befanden sich vier bis sieben Tiere. Die Genexpression wurde jeweils auf das Haushaltsgen Hprt normalisiert. Dargestellt ist der arithmetische Mittelwert und der SEM, die statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA. **: p ≤ 0,01; #: TH1 vs TH17 p ≤ 0,05; $: TH17 vs PBS p ≤ 0,05. a) relativer Gewichtsverlust; b) Endoskopischer Kolitis score; c) Kolonlänge d) Lebertransaminasen aus venösem Blut; e) Expressionsanalyse pro-fibrotischer Gene Cola1a1, Acta2 und Timp1 aus Lebergewebe.
Wie an Hand des relativen Gewichtsverlusts sowie dem endoskopischen Kolitis Score zu erkennen ist, führte nur der Transfer von in vitro differenzierten TH17 Zellen zur Ausbildung einer milden Dickdarmentzündung (Abbildung 9a, b). Die Kolonlänge war jedoch nur in der Tendenz bei den Mäusen, die TH17 Zellen erhalten hatten, leicht verringert (Abbildung 9c).
Bei der Betrachtung der Lebertransaminasen zeigte sich keine Auswirkung der Kolitis auf die leberspezifische ALT. Bei der AST fiel eine signifikante Erhöhung bei der TH17 Gruppe im Vergleich zu den Tieren die PBS erhalten hatten auf (Abbildung 9d). Sowohl die hepatische
0 100 200 300
40 0
50 100
30
5 6 7 8 9 10
0 1 2 3 4
0 5 10 15
0 2 4 6
0.9 1.0 1.1
Relativer Gewichtsverlust Endoskopischer Kolitis score Kolonlänge (cm)
Wochen nach Versuchsbeginn PBS
a b c
Wochen nach Versuchsbeginn TH0 TH1 TH17
PBS TH0 TH1 TH17
PBS TH0 TH1 TH17
d
U/L
ALT AST
n.s.
n.s.
n.s. n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s. n.s.
n.s.
**
n.s.
n.s. n.s.
n.s.
#
$
10-4 10-3 10-2 10-1 100
10-4 10-3 10-2 10-1 100
10-4 10-3 10-2 10-1 100
mRNA Expression
PBS TH0 TH1 TH17 PBS TH0 TH1 TH17 PBS TH0 TH1 TH17
e *
n.s.
n.s. n.s.
n.s.
* n.s.
n.s. n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s. n.s.
n.s.
Cola1a1 Acta2 Timp1
Expression von Kollagen Typ I alpha 1 als auch von Timp1 waren in der Gruppe, die die TH17 Zellen erhalten hatten im Vergleich zu den PBS-Kontrollen signifikant erhöht (Abbildung 9e).
Abbildung 10: Analyse der unterschiedlichen CD4+ T-Zellen sowie der Zellen des angeborenen Immunsystems in der Leber bei einer T-Zell-abhängigen Kolitis in Rag1-/--Mäusen. TH0, TH1 und TH17 Zellen wurden in vitro differenzierte und jeweils 105 Zellen sowie PBS als unbehandelte Kontrolle in Rag1-/ --Mäusen mittels i.p. Injektion transferiert. In jeder Versuchsgruppe befanden sich vier bis sieben Tiere. Dargestellt ist der arithmetische Mittelwert und der SEM, die statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA. *: p ≤ 0,05; **: p ≤ 0,01. a) Frequenz der CD45.2+- und CD45.1+-Zellen in der Leber;
b) Frequenz der granulozytären und monozytären Zellen in der Leber; c) Frequenz der IFNγ+, IL-17A+, IL-17A+ und IFNγ+ doppelt positiven sowie Foxp3+ CD4+-T-Zellen in der Leber.
Wie bereits zuvor bei der DSS-Kolitis beobachtet, führte die Entzündung im Darm bei den Tieren, die TH17 Zellen erhalten hatten zu einer erhöhten Frequenz an CD45.2+ Zellen in der Leber. Aber auch die Mäuse, in die TH1 Zellen transferiert wurden, wiesen eine signifikante Erhöhung der Frequenz der CD45.2+ Zellen in der Leber auf. Dabei ist wichtig zu erwähnen, dass die transferierten T-Zellen CD45.2+ und die Rag1-/- Mäuse congen, also CD45.1+ waren.
Die Frequenz der CD45.1+ Zellen war dem entsprechend bei den Tieren die TH1 oder TH17 Zellen erhalten hatten im Vergleich zu den Tieren die PBS erhalten hatten erniedrigt (Abbildung 10a). Bei der weiteren Analyse der T-Zellsubpopulation in der Leber zeigte sich, dass sich ausschließlich in der TH17-Gruppe eine signifikant erhöhte Frequenz an TH17 Zellen nachweisen lies. Für die TH1, TH1+TH17 und Treg Zellen konnten keine signifikanten Unterschiede in den unterschiedlichen Versuchsgruppen festgestellt werden (Abbildung 10c).
Bei der Betrachtung der Zellen des angeborenen Immunsystems zeigte sich, dass bei den mit TH17 Zellen behandelten Mäusen im Vergleich zu der PBS-Gruppe die Frequenz der granulozytären Zellen signifikant erhöht war. Die monozytären Zellen waren dagegen in der
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
0.0 0.5 1.0 1.5
0 2 4 6
0 10 20 30
40 60 80 100
0 20 40 60
IFNγ+IL-17A- IFNγ-IL-17A+ IFNγ+IL-17A+
% der CD4+-Zellen
CD45.2+
% der hämatopoetischen Zellen
Foxp3+
PBS a
c
CD45.1+
0 20 40 60
Ly6G+
0 5 10 15 20 25
Ly6C+
% der CD45.1+-Zellen
TH0 TH1 TH17 TH0 TH1 TH17 TH0 TH1 TH17 TH0 TH1 TH17
TH0 TH1 TH17 PBS TH0 TH1 TH17 PBS TH0 TH1 TH17 PBS TH0 TH1 TH17
b
**
*
*
* *
n.s. n.s.
n.s.
** n.s.
n.s.
n.s. n.s.
n.s.
n.s. n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s. n.s.
n.s. n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
* n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
Versuchsgruppe, die TH0 Zellen erhalten hatte, im Vergleich zu der PBS-Gruppe signifikant erhöht (Abbildung 10d).
Die Analyse der Expression der pro-inflammatorischen Cytokine Il6 und Tnfa aus Lebergewebe zeigte, dass diese Gene insbesondere in den Lebern der Tiere verstärkt exprimiert wurden, die TH17 Zellen erhalten hatten (Abbildung 11a). Passend zu den erhöhten Frequenzen an granulozytären Zellen in den Lebern von Tieren, die TH17 Zellen erhalten hatten, war bei diesen Tieren ebenfalls die Expression des Cxcl1 im Vergleich zu den PBS-behandelten Tieren erhöht (Abbildung 11b). Interessanterweise war bei diesen Tieren im Vergleich zu der PBS-Gruppe die Expression von Ifng in der Leber signifikant erhöht (Abbildung 11c). Die Detektion der Il17a Genexpression in der Leber war bei zu geringer Expression nicht möglich.
Abbildung 11: Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen in der Leber am Ende einer T-Zell-abhängigen Kolitis in Rag1-/- Mäusen. TH0, TH1 und TH17 Zellen wurden in vitro differenzierte und jeweils 105 Zellen sowie PBS als unbehandelte Kontrolle in Rag1-/ - Mäusen mittels i.p. Injektion transferiert. In jeder Versuchsgruppe befanden sich vier bis sieben Tiere. Die Genexpression wurde jeweils auf das Haushaltsgen Hprt normalisiert. Dargestellt ist der arithmetische Mittelwert und der SEM, die statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA. **: p ≤ 0,01. a) Expression von Il6 und Tnfa in der Leber; b) Expression von Cxcl1 und Ccl25 in der Leber; d) Expression von Ifng in der Leber.
Abschließend kann festgehalten werden, dass lediglich der Transfer von in vitro differenzierten TH17 Zellen zur Ausprägung einer milden Kolitis führte. Dabei konnte in der Leber jedoch nur eine milde Entzündung nachgewiesen werden. Die Transaminasen waren ausschließlich in Form der AST erhöht. Ähnlich wie bei der DSS-Kolitis kam es auch bei diesem Kolitis-Modell zu einer Akkumulation von pro-inflammatorischen Zellen mit einer verstärkten Expression von pro-inflammatorischen Genen in der Leber.
10-2 10-1 100 101
10-3 10-2 10-1
10-3 10-2 10-1
Il6 Tnfa Cxcl1
mRNA Expression
a b
mRNA Expression
PBS TH0 TH1 TH17 PBS TH0 TH1 TH17 PBS TH0 TH1 TH17
**
n.s.
n.s. n.s.
n.s.
**
n.s.
n.s. n.s.
n.s.
* n.s.
n.s. n.s.
n.s.
10-4 10-3 10-2 10-1
Ifng c
mRNA Expression
PBS TH0 TH1 TH17
**
n.s.
n.s. n.s.
n.s.
10-2 10-1 100 101
Ccl25 n.s.
n.s.
n.s. n.s.
n.s.
PBS TH0 TH1 TH17
Auf der Grundlage der Vorarbeiten mit der DSS-Kolitis in Wildtyp-Mäusen und der Transferkolitis in Rag1-/- Mäusen stellte sich als nächstes die Frage, ob eine Kolitis den PSC-ähnlichen Phänotyp in genetisch prädisponierten Tieren verstärken würde.
3.2 Einfluss einer DSS-Kolitis auf die Leberpathologie bei Tieren mit