Hypothese II: Die PSC begünstigt die Entstehung einer Kolitis durch die Änderung des Mikrobioms, die durch eine Änderung der Gallensäurezusammensetzung vermittelt wird. Um
3 Ergebnisse
3.6 Die Rolle der MMP8 in dem beobachteten Phänotyp
Abbildung 47: Klinische Parameter einer chronischen DSS-Kolitis nach der Transplantation von Mmp8-/- oder Wildtyp-Knochenmark in Mdr2-/- Mäusen. Vier Wochen vor Beginn der DSS-Behandlung wurden die Empfängertiere letal mit 9 Gy bestrahl und mit dem Donorknochenmark rekonstituiert. Anschließend wurde den Tieren in insgesamt drei Zyklen 2,5 % DSS ad libitium im Trinkwasser verabreicht, zwischen den Zyklen erhielten sie autoklaviertes Leitungswasser. Jedes in den Abbildungen dargestellte Symbol repräsentiert ein Versuchstier. Die Genexpression wurde jeweils auf das Haushaltsgen Hprt normalisiert. Dargestellt ist der arithmetische Mittelwert und der SEM. Die statistische Auswertung war auf Grund der geringen Gruppegröße nicht möglich. a) relativer Gewichtsverlust; b) endoskopischer Kolitis score; c) relative Expression des Mmp8 Gens im Lebergewebe; d) histopathologische Beurteilung der Entzündungsaktivität in der Leber an Hand von HE-gefärbten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten; e) histopathologische Beurteilung der Leberfibrose an Hand von gefärbten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten; f) Lebertransaminasen aus venösem Blut; g) repräsentative, HE-gefärbte histologische Bilder der Leber in 10-facher Vergrößerung; h) Expressionsanalyse profibrotischer Gene Cola1a1, Acta2 und Timp1 aus Lebergewebe.
Betrachtet man den klinischen Verlauf der DSS-Kolitis, so zeigt sich, dass weder im Gewichtsverlauf, noch im endoskopischen Kolitis Score deutliche Unterschiede zwischen den beiden DSS-behandelten Gruppen bestanden (Abbildung 47a, b). Bei der histologischen Beurteilung der Entzündungsaktivität in der Leber konnten zwischen den vier Versuchsgruppen keine Unterschiede festgestellt werden (Abbildung 47d). Bei der Betrachtung des Fibrosegrades zeigte sich dagegen, dass die Tiere, die DSS erhalten hatten tendenziell eine verringerte Fibrose aufwiesen. Dabei zeigten die Tiere, die das Wildtyp-Knochenmark erhalten hatten nach der Kolitisinduktion eine deutlichere Reduktion der
10-4 10-3 10-2 10-1
10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 101
0 20 40 60
0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2
0 5 10 15
0 200 400 600 800
0 200 400 600 800 1000
0 1 2 3 4
0 5 10 15 18
U/L
Relativer Gewichtsverlust Endoskopischer Colitis score Tage nach Versuchsbeginn
ALT AST
mHAI-Score Histologischer Grad der Fibrose
WT KM WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM Mm
p8-/- KM
+ 2,5% DSS WT KM
WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM Mm
p8
-/- KM
+ 2,5% DSS WT KM
WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM Mm
p8-/- KM + 2,5% DSS
WT KM WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM Mm
p8-/- KM + 2,5% DSS Mmp8
a b c
d e f
50 µm 50 µm 50 µm 50 µm
WT KM WT KM + 2,5% DSS Mmp8-/- KM Mmp8-/- KM + 2,5% DSS
x10 g
10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 101
10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 101
WT KM WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM Mm
p8
-/- KM
+ 2,5% DSS
WT KM WT KM + 2,5% DSS
Mm p8
-/- KM
Mm p8-/-
KM + 2,5% DSS
WT KM WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM Mm
p8-/- KM + 2,5% DSS
Cola1a1 Acta2 Timp1
h
mRNA Expression mRNA Expression
Fibrose im Vergleich zu den Tieren, die das Knochenmark der Mmp8-/- Mäuse erhielten (Abbildung 39e). Die Analyse pro-fibrotischer Gene in der Leber zeigte keine Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen (Abbildung 47h). Bei der Analyse der Lebertransaminasen fiel erneut auf, dass die DSS behandelten Tiere im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren deutlich reduzierte Werte aufwiesen (Abbildung 47f). Dabei spielte es offensichtlich keine Rolle, welches Knochenmark die Tiere zuvor erhalten hatten.
Abbildung 48: T-Zellzusammensetzung in die Leber bei einer chronischen DSS-Kolitis bei Mdr2-/- Mäusen die zuvor eine Konchenmarktransplantation mit Knochenmark von Wildtyp oder Mmp8-/- Mäusen erhalten hatten. Vier Wochen vor Beginn der DSS-Behandlung wurden die Empfängertiere letal mit 9 Gy bestrahl und mit dem Donorknochenmark rekonstituiert.
Anschließend wurde den Tieren in insgesamt drei Zyklen 2,5 % DSS ad libitium im Trinkwasser verabreicht, zwischen den Zyklen erhielten sie autoklaviertes Leitungswasser. Jedes in den Abbildungen dargestellte Symbol repräsentiert ein Versuchstier. Dargestellt ist der arithmetische Mittelwert und der SEM. Die statistische Auswertung war auf Grund der geringen Gruppegröße nicht möglich. a) Frequenz und b) absolute Zellzahl der CD4+ T-Zellen; c) Frequenz und absolute Zellzahl der IFNγ+, IL-17A+, IL-17A+ und IFNγ+ doppelt positiven sowie Foxp3+ CD4+ T-Zellen.
Bei der Analyse der T-Zellen in der Leber zeigte sich, dass insbesondere bei den Tieren, die das Wildtypknochenmark erhalten hatten und mit DSS behandelt wurden, die Frequenz und Anzahl an TH17 Zellen im Vergleich zu allen übrigen Versuchsgruppen erhöht war (Abbildung 48). Beide DSS-behandelten Versuchsgruppen wiesen erhöhte Frequenzen und absolute Zellzahlen an TH1+TH17 Zellen in der Leber auf. Bei den übrigen untersuchten T-Zellsubpopulationen konnten dagegen keine nennenswerten Unterschiede für die Versuchsgruppen festgestellt werden.
0 2 4 6 8 0 5 10 15
0 2 4 6 8 10
0.5 1.0 1.5 2.0
0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 1 2 3
0 5 10 15 0 5 10 15 20
0 50 100 150 200
%der CD4+-Zellen
CD4+
%der CD45+-Zellen CD4+
Zellen / g Lebergewebe (103)
IFNγ+IL-17A- IFNγ-IL-17A+ IFNγ+IL-17A+
IFNγ+IL-17A- IFNγ-IL-17A+ IFNγ+IL-17A+ Foxp3+
Foxp3+
Zellen / g Lebergewebe (103) a
a
b
c
Abbildung 49: Zell des angeborenen Immunsystems in die Leber bei einer chronischen DSS-Kolitis bei Mdr2-/- Mäusen die zuvor eine Konchenmarktransplantation mit Knochenmark von Wildtyp oder Mmp8-/- Mäusen erhalten hatten. Vier Wochen vor Beginn der DSS-Behandlung wurden die Empfängertiere letal mit 9 Gy bestrahl und mit dem Donorknochenmark rekonstituiert. Anschließend wurde den Tieren in insgesamt drei Zyklen 2,5 % DSS ad libitium im Trinkwasser verabreicht, zwischen den Zyklen erhielten sie autoklaviertes Leitungswasser. Jedes in den Abbildungen dargestellte Symbol repräsentiert ein Versuchstier. Dargestellt ist der arithmetische Mittelwert und der SEM. Die statistische Auswertung war auf Grund der geringen Gruppegröße nicht möglich.
Bei der Analyse der Zellen des angeborenen Immunsystems (Abbildung 49) konnte gezeigt werden, dass bei beiden mit DSS-behandelten Gruppen erhöhte Frequenzen und Zellzahlen an granulozytären Zellen in der Leber zu finden waren. Bei der Betrachtung der monozytären Zellen zeigte sich dagegen, dass zwar bei beiden DSS-Kolitis Gruppen die Frequenzen und Zellzahlen im Vergleich zu den unbehandelten Tieren erhöht waren, jedoch war dieser Effekt bei der Versuchsgruppe, die das Mmp8-/- Knochenmark erhalten hatte weniger deutlich ausgeprägt.
Abbildung 50: Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen in der Leber bei einer chronischen DSS-Kolitis bei Mdr2-/- Mäusen die zuvor eine Konchenmarktransplantation mit Knochenmark von Wildtyp oder Mmp8 -/-Mäusen erhalten hatten. Vier Wochen vor Beginn der DSS-Behandlung wurden die Empfängertiere letal mit 9 Gy bestrahl und mit dem Donorknochenmark rekonstituiert. Anschließend wurde den Tieren in insgesamt drei Zyklen 2,5 % DSS ad libitium im Trinkwasser verabreicht, zwischen den Zyklen erhielten sie autoklaviertes Leitungswasser. Jedes in den Abbildungen dargestellte Symbol repräsentiert ein Versuchstier. Die Genexpression wurde jeweils auf das Haushaltsgen Hprt normalisiert. Dargestellt ist der arithmetische Mittelwert und der SEM, die statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA.
n.s.: nicht signifikant; n.d.: nicht detektiert. a) Expression von Il6 und Tnfa in der Leber; b) Expression von Ifng und Il17a in der Leber.
Die Analyse der Expression der pro-inflammatorischen Gene in der Leber zeigte keine Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsgruppen (Abbildung 50). Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die hämatopoetische MMP8 Expression im Rahmen der DSS-Kolitis für die erniedrigten Lebertransaminasen der Mdr2-/- nicht essentiell zu sein scheint.
0 50 100 150 200
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
0 2 4 6 8 10
Ly6G+
%der CD45+-Zellen
Ly6C+ Ly6G+ Ly6C+
Zellen / g Lebergewebe (103)
WT KM
WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM
Mm p8-/-
KM + 2,5% DSS
WT KM
WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM
Mm p8
-/- KM
+ 2,5% DSS
WT KM
WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM
Mm p8-/-
KM + 2,5% DSS
WT KM
WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM
Mm p8-/-
KM + 2,5% DSS
10-5 10-4 10-3 10-2 10-1
10-5 10-4 10-3 10-2 10-1
10-5 10-4 10-3 10-2
10-5 10-4 10-3 10-2
mRNA Expression mRNA Expression
a Il6 Tnfa b Ifng Il17a
1/3 n.d.
1/3 n.d.
WT KM
WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM
Mm p8-/-
KM + 2,5% DSS
WT KM
WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM
Mm p8
-/- KM
+ 2,5% DSS
WT KM
WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM
Mm p8-/-
KM + 2,5% DSS
WT KM
WT KM + 2,5% DSS
Mm p8-/-
KM
Mm p8-/-
KM + 2,5% DSS
Bezüglich der Auswirkung der MMP8 auf die Leberfibrose lässt sich, bei der geringen Mauszahl in diesem Experiment, keine klare Aussage treffen.
3.7 Einfluss einer DSS-Kolitis auf die Gallensäurenzusammensetzung bei