Transfer in wässrige Lösung und Charakterisierung unter physiologischen

Ähnlich wie die carboxy-funktionalisierten Partikel zeigen auch die amino-funktionalisierten Partikel ein pH-abhängiges Löslichkeitsverhalten in wässriger Lösung.

Die amino-funktionalisierten Partikel aggregieren unter neutralen Bedingungen sofort, sind aber in saurer wässriger Lösung löslich (pH < 3, eingestellt mit Salzsäure). Die Degradation der Partikel durch Säure kann auf Grund von TEM-Messungen

0.0 2.0x10¹⁰ 4.0x10¹⁰ 6.0x10¹⁰ 0.051

0.052 0.053 0.054 0.055 0.056 0.057 0.058 0.059 0.060

B

Linear Fit of B Linear Fit of B

1/R h / nm-1

q² / cm^-2

Equation y = a + b*x

Adj. R-Square 0

Value

B Intercept 0.05916

B Slope 0

Equation y = a + b*x Adj. R-Square 0.87174

Value

B Intercept

B Slope 4.04866E-14

R_h = 17.7 nm

0.0 2.0x10

¹⁰

4.0x10

¹⁰

6.0x10

¹⁰

0.051

0.052 0.053 0.054 0.055 0.056 0.057 0.058 0.059 0.060

B

Linear Fit of B Linear Fit of B

1/R

h

/ nm

-1

q

²

/ cm

^-2

Equation y = a + b*x

Adj. R-Square 0

Value

B Intercept 0.05916

B Slope 0

Equation y = a + b*x Adj. R-Square 0.87174

Value

B Intercept

B Slope 4.04866E-14

R

_h

= 17.7 nm

100 nm

-65-

ausgeschlossen werden (Anhang, Abbildung 12.2, S. 156). Wird der pH-Wert an Stelle von Salzsäure mit 0.1 N MES-Puffer (Abbildung 5.7, links) eingestellt, so sind die Partikel auch bei etwas höheren pH-Werten von 5-6 löslich und können mittels Dialyse in den MES-Puffer überführt werden. MES fungiert anscheinend bei dem Lösevorgang der Partikel ähnlich wie ein kurzkettiges Tensid und trägt so zur Stabilisierung der Partikel in wässriger Lösung bei. Außerdem kann auch ein möglicher Gegenioneneffekt die Löslichkeit der Partikel in MES beeinflussen, da die Sulfonatgruppe von MES ein deutlich weicheres Gegenion darstellt als Hydroxid-Anionen, die in reinem Wasser wahrscheinlich als Gegenion fungieren.

Abbildung 5.7: Links: Winkelabhängigkeit der reziproken hydrodynamischen Radien der amino-funktionalisierten Poly(organosiloxan)-Nanopartikel nach Transfer aus Methanol in 0.1 M MES-Puffer und 10facher Verdünnung mit 5 mM Natriumchloridlösung (Probe POS-NH₂1, c = 1.0 mg/mL) nach der biexponentiellen Anpassung der Autokorrelationfunktionenen sowie Extrapolation q²à0. T = 296 K. Rechts:

2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES).

Das ζ-Potential der amino-funktionalisierten Poly(organosiloxan)-Nanopartikel (POS-NH21) wurde bestimmt zu (31 ± 3) mV in 0.1 M MES-Puffer mit 5 mM Natriumchlorid (pH ≈ 5-6) und ist positiv, da die Aminogruppe protoniert vorliegt.¹³⁵

Die Größenbestimmung der Partikel in Lösung nach Transfer in MES-Puffer aus Methanol durch Dialyse wurde mittels DLS durchgeführt. Abbildung 5.7 zeigt die Winkelanhängigkeit der inversen hydrodynamischen Partikelradien. Der hydrodynamische Radius der Partikel wurde bestimmt zu 14.8 nm (µ2 = 0.24). Bei der

0.0 2.0x10¹⁰ 4.0x10¹⁰ 6.0x10¹⁰ 0.050

0.055 0.060 0.065 0.070 0.075 0.080

R_h = 14.8 nm

1/R h / nm-1

q² / cm^-2

Equation y = a + b*x Adj. R-Square 0.93146

1/Rh Intercept

1/Rh Slope

Equation y = a + b*x Adj. R-Square 0.27649

1/Rh Intercept

1/Rh Slope

Equation y = a + b*x

Adj. R-Square 0

Value

1/Rh Intercept 0.07397

1/Rh Slope 0

O N

S OH O

O

0.0 2.0x10

¹⁰

4.0x10

¹⁰

6.0x10

¹⁰

0.051

0.052 0.053 0.054 0.055 0.056 0.057 0.058 0.059 0.060

B

Linear Fit of B Linear Fit of B

1/R

h

/ nm

-1

q

²

/ cm

^-2

Equation y = a + b*x

Adj. R-Square 0

Value

B Intercept 0.05916

B Slope 0

Equation y = a + b*x Adj. R-Square 0.87174

Value

B Intercept

B Slope 4.04866E-14

R

_h

= 17.7 nm

-66-

Messung mussten die Partikel mit Natriumchlorid verdünnt werden, um die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den Partikeln abzuschwächen. Der hydrodynamische Radius der Partikel in MES-Puffer mit Natriumchlorid fällt kleiner aus als in Methanol. Dennoch zeigt auch die mit MES stabilisierte Probe eine leichte Winkelabhängigkeit der reziproken hydrodynamischen Radien (Rh,App (θ = 150°) = 13.5 nm) und hat einen hohen µ2-Wert, was wieder auf Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Partikeln und eine Tendenz der Partikel zur Agglomeration hindeutet.

Die amino-funktionalisierten Partikel sind nicht in Wasser bei physiologischen pH-Werten von 7-8 löslich und können nicht aus Methanol mittels Dialyse direkt in Wasser überführt werden. Nach dem Transfer aus Methanol in den wässrigen MES-Puffer mittels Dialyse ist allerdings auch der Transfer in reines Wasser in einem weiteren Dialyseschritt möglich. Anscheinend bleibt eine Restmenge MES adsorptiv an das Siloxan-Netzwerk gebunden und trägt zur Stabilisierung der Nanopartikel in wässriger Lösung bei.

Abbildung 5.8: Winkelabhängigkeiten der reziproken hydrodynamischen Radien 1/R_h,z amino-funktionalisierter Poly(organosiloxan)-Nanopartikel (c = 0.04 mg/mL) nach Transfer aus MES-Puffer ins Wasser. Links: In Wasser. Rechts: In RPMI 1640 mit 5 Gew.-%

FCS. — Extrapolation q²à 0 bei θ = 26-150°. - -Extrapolation q²à 0 bei θ = 114°-150°.

T = 296 K.

Die gegen Wasser dialysierten Partikel wurden ebenfalls mit der DLS vermessen. In Abbildung 5.8 ist der Verlauf der reziproken hydrodynamischen Radien in Abhängigkeit

0.0 2.0x10¹⁰ 4.0x10¹⁰ 6.0x10¹⁰ 0.00

0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09

1/Rh

Linear Fit of 1/Rh

1/Rh / nm-1

q² / cm^-2 Rh = 13.5 nm

0.0 2.0x10¹⁰ 4.0x10¹⁰ 6.0x10¹⁰ 0.00

0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09

1/Rh

Linear Fit of 1/Rh Linear Fit of 1/Rh

1/Rh / nm-1

q² / cm^-2

Equation y = a + b*x Adj. R-Square 0.86053

1/Rh Intercept

1/Rh Slope

Equation y = a + b*x Adj. R-Square

1/Rh Intercept

1/Rh Slope

R_h = 50.1 nm R_h = 128 nm

-67-

des Quadrats des Streuvektors q² dargestellt. Der hydrodynamische Radius der Partikel in Wasser wurde durch Extrapolation q²à 0 zu 13.5 nm (µ2 = 0.11) bestimmt. Die Lösung wurde bei sehr niedriger Partikelkonzentration c = 0.04 mg/mL vermessen. Bei dieser Partikelkonzentration wird ein winkelunabhängiger Verlauf der inversen hydrodynamischen Radien beobachtet. Auch der µ2-Wert nimmt nach Transfer der Partikel aus MES-Puffer in Wasser von 0.24 auf 0.11 ab. Die Partikel in MES-Puffer vor Transfer in reines Wasser wurden bei einer höheren Konzentration c = 1.0 mg/mL vermessen als die gegen Wasser dialysierten Partikel. Durch Verdünnung der Partikel werden die Wechselwirkungen zwischen den Partikeln abgeschwächt, was die Abnahme des µ2-Wertes zur Folge hat. Die Vermutung, dass die hohen Werte des zweiten Kumulanten µ2 und die damit verbundene breite Verteilung der Partikelradien in MES-Puffer durch eine reversible Interaktion zwischen den Partikel verursacht werden, wird dadurch bestätigt. Es liegen demnach einzelne Partikel und evtl. wenige Agglomerate in wässriger Lösung nach der Dialyse gegen Wasser vor.

Die adsorptive Bindung von MES ist nicht ausreichend, um Partikel im Zellkulturmedium RPMI 1640 zu stabilisieren. Bei der Zugabe der Partikel zum Medium bilden sich sofort mit bloßem Auge sichtbare Agglomerate. Durch die hohe Salzkonzentration im Zellkulturmedium wird die für die elektrostatische Stabilität der Partikel notwendige Abstoßung zwischen den Partikel aufgehoben, was die unmittelbare Aggregation der Probe zur Folge hat.

Im serumhaltigen Zellkulturmedium bleiben die Partikel gelöst. Sie bilden allerdings Agglomerate mit einem hydrodynamischen Radius von 128 nm (Abbildung 5.8, rechts).

Die Abschirmung der Partikeloberfläche durch die adsorbierten Proteine führt zur Stabilisierung der Partikel unter physiologischen Bedingungen. Es entsteht eine Art Interpolyelektrolyt-Komplex zwischen den positiv geladenen Partikel und den negativ geladenen Proteinen.¹³⁶ Die gebildeten Nanopartikel-Protein-Komplexe weisen hohe Polydispersitäten auf, was durch die Winkelabhängigkeit der hydrodynamischen Radien veranschaulicht wird: Die Extrapolation q²à 0 der inversen Radien bei allen Winkeln ergibt einen hydrodynamischen Radius von 128 nm. Wird die Extrapolation nur mit den großen Winkel θ = 114°-150° durchgeführt, so wird ein kleinerer Wert von 50.1 nm bestimmt. Eine genaue Größenbestimmung mit der DLS ist somit auf Grund der starken Polydispersität der Nanopartikel-Protein-Komplexe nicht möglich.

-68-

Amino-funktionalisierte Partikel zeigen somit ein völlig anderes Verhalten unter physiologischen Bedingungen auf als die carboxy-funktionalisierten Teilchen, die auf Grund ihrer negativen Ladung auch unter physiologischen Bedingungen kolloidal stabil bleiben.

Das Verhalten der amino-funktionalisierten Partikel zeigt, dass die Oberflächeneigenschaften der Teilchen sich nach dem Kontakt mit den Serumproteinen deutlich verändern können. Die Rolle der Oberflächenfunktionalisierung im Bezug auf mögliche Wechselwirkungen der Nanopartikel mit lebenden Organismen und die Bedeutung der Proteinkorona sollen in weitergehenden Studien mit komplexen Zellkulturmodellen untersucht werden.

-69-

6 Sterisch stabilisierte

Im Dokument Multifunktionelle Poly(organosiloxan)-Nanopartikel als Modellsystem für biomedizinische Anwendungen (Seite 72-77)