Darstellung der biotinylierten Nanopartikel

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PEG@POS-COOH2 und den PIPOXylierten Partikeln PIPOX@POS-COOH, die in den vorherigen Unterabschnitten 6.3 und 6.4 bereits ausführlich diskutiert wurden.

Im Gegensatz zu den Partikeln PEG@POS-NH2 adsorbieren die PEGylierten Partikel, die aus den carboxy-funktionalisierten Partikeln POS-COOH dargestellt wurden, nur sehr wenige Serumproteine. Der hydrodynamische Radius erhöht sich in Anwesenheit der Serumproteine lediglich um 1-2 nm. Bei der Verwendung von dem etwas hydrophoberen PIPOX als Pfropfpolymer anstelle von PEG wird eine Zunahme der Proteinadsorption bzw. Agglomeration beobachtet.

Mit den amino-funktionalisierten Partikeln POS-NH2 als Edukt-Partikel erhält man Nanopartikel, die nach PEGylierung in Anwesenheit der Serumproteine agglomerieren.

Es entstehen Nanopartikel-Protein-Agglomerate, die fast dreimal so groß sind wie die Partikel selbst. PEG ist scheinbar nicht alleine entscheidend für die Art und Stärke der Wechselwirkungen, die zwischen Nanopartikeln und Serumproteinen vorliegen. Die Proteinadsorption wird auch durch die nach außen „sichtbare“ Ladung der Partikel beeinflusst.

Um eine bessere Kenntnis über die Proteinadsorption zu erlangen ist eine detaillierte Untersuchung der Proteinzusammensetzung der Proteinkorona notwendig, die über den Rahmen dieser Arbeit hinausgeht und von D. Docter in Rahmen seiner Dissertation an der Universitätsmedizin Mainz durchgeführt wird.

6.6 Biofunktionalisierung der sterisch stabilisierten

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werden. Deshalb werden bei der Adressierung der Nanopartikel an bestimmte Zellen oft PEGylierte Nanopartikel eingesetzt, die für gewöhnlich nur eine geringe Proteinadsorption und unkontrollierte Zelladhäsion aufweisen.^14,18

Zur Biofunktionalisierung der sterisch-stabilisierten Poly(organosiloxan)-Nanopartikel wird in dieser Arbeit Biotin, auch Vitamin B7 genannt, verwendet. Biotin, spielt eine bedeutende Rolle im Kohlenhydratmetabolismus, in dem es bei der Glyconeogenese als Coenzym der Pyruvatcarboxylase fungiert und aktiviertes CO2 transportiert.⁴²

Für die Biofunktionalisierung der Nanopartikel ist vor allem die Eigenschaft von Biotin eine spezifische Bindung zu den Glykoproteinen Avidin und Streptavidin aufzubauen besonders interessant.¹⁶⁷ So könnten Streptavidin-konjugierte Biomoleküle auf der Oberfläche der biotinylierten Poly(organosiloxan)-Nanopartikel immobilisiert werden. Streptavidin besteht aus vier Untereinheiten und kann somit bis zu vier Moleküle Biotin binden. Durch diese Eigenschaft wird auch eine nicht-kovalente Weitermodifizierung der Oberfläche der biotinylierten Partikel mit biotinylierten Biomolekülen möglich, bei der Streptavidin als eine Art Linker fungiert. Denkbar wäre beispielsweise die Bindung von Antikörpern oder Enzymen an die Partikeloberfläche.

Schließlich könnten auch komplexere supramolekulare Strukturen aufgebaut werden, die aus den biotinylierten Poly(organosiloxan)-Nanopartikel, Streptavidin und weiteren biotinylierten Biomolekülen oder synthetischen Polymeren bestehen.

Auch in der Onkologie könnten die biotinylierten Nanopartikel eine Anwendung finden. Der Biotin-Rezeptor ist bei vielen Krebsarten, vor allem bei den Leberkarzinomen oft überexprimiert. Somit könnten die biotinylierten Poly(organosiloxan)-Nanopartikel nach einer Funktionalisierung mit Krebsmedikamenten für den gezielten Wirkstofftransport zu Tumorzellen eingesetzt werden.¹⁶⁸

6 STERISCH STABILISIERTE POLY(ORGANOSILOXAN)-NANOPARTIKEL

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Schema 6.4: Darstellung biotinylierter Poly(organosiloxan)-Nanopartikel. Die Kupplung von Biotin erfolgt an PEGylierte Poly(organosiloxan)-Nanopartikel in einer EDC-vermittelten Kupplungsreaktion.

Die Modifizierung der Partikeloberfläche mit Biotin erfolgt ausgehend von PEGylierten Poly(organosiloxan)-Nanopartikeln PEG@POS-COOH3b, die zuvor durch Umsetzung der maleinimido-funktionalisierten Partikel POS-COMal mit heterobifunktionellem HS-PEG-COOH hergestellt wurden (Vgl. Abschnitt 6.3, S. 73).

Als Biotinylierungsreagenz wird amino-funktionalisiertes Biotin mit einem kurzen PEG-Linker eingesetzt. Die Kupplung von Biotin erfolgt in 0.1 M MES-Puffer (pH ≈ 4-6) in einer EDC-vermittelten Kupplungsreaktion (Schema 6.4).¹⁶⁷

Tabelle 6.6: Vergleich der ζ-Potentiale der biotinylierten Nanopartikel mit den Edukt-Partikeln und Blindprobe bei verschiedenen pH-Werten. Messung in wässriger Natriumchloridlösung oder wässrigem Glycin-Puffer mit 5 mM Natriumchlorid (saurer Puffer mit Salzsäure bzw. basischer mit Natronlauge). T = 295 K.

Edukt-Partikel PEG@POS-COOH3b

Biotinylierte

Partikel Blindprobe ζ-Potential

(Glycin-Puffer, pH ≈ 3.0) -1 ± 0 8 ± 1 6 ± 0

ζ-Potential (5 mM NaCl,

pH ≈ 7) -12 ± 1 -7 ± 1 -10 ± 2

ζ-Potential

(Glycin-Puffer, pH ≈ 8.5) -15 ± 2 -14 ± 2 -21 ± 2

Der Erfolg der Kupplungsreaktion kann mit ζ-Potential-Messungen überprüft werden.

Tabelle 6.6 zeigt den Vergleich der ζ-Potentiale der biotinylierten Partikel mit der

nicht-COOH COOH

COOH COOH

COOH HOOC

COOH HOOC

HOOC HOOC

HN NH S O HN

H2N O 3 O

HN NH

S O

S NH

HN O

NH HN S

O HN

NH S O

HN O NH

COOH

HOOC COOH HOOC

HN NH S O

HN NH S

O NH HN

S O

HN NH S

O COOH

EDC 0.1 N MES-Puffer PEG@POS-COOH3b

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biotinylierten, PEGylierten Vorstufe PEG@POS-COOH3b und der Blindprobe, die ohne den Zusatz von EDC unter den sonst gleichen Bedingungen wie die biotinylierten Partikel hergestellt wurde. Die ζ-Potentiale der biotinylierten Partikel sind deutlich höher als die Potentiale der Edukt-Partikel, was generell für den erfolgreichen Verlauf der Funktionalisierung spricht. Allerdings weist auch die Blindprobe, die ohne Zusatz von EDC hergestellt wurde, ebenfalls höhere ζ-Potentiale auf als die Edukt-Partikel. Es müssen höchstwahrscheinlich adsorptive Wechselwirkungen zwischen den Poly(organosiloxan)-Nanopartikeln und Biotin vorliegen, da bei der Blindprobe eine kovalente Bindung zwischen Biotin und den Partikel ausgeschlossen werden kann. Die ζ-Potentiale der Blindprobe sind allerdings etwas niedriger als die ζ-Potentiale der biotinylierten Nanopartikel. Dies lässt die Annahme zu, dass bei der in Anwesenheit von EDC dargestellten Probe sowohl kovalente als auch adsorptive Bindungen zwischen dem Biotin und den Partikeln vorliegen, während die in Abwesenheit von EDC dargestellte Blindprobe Biotin über eine rein adsorptive Bindung bindet. Die Menge des an die Partikel gebundenen Biotins konnte anhand der vorliegenden Daten nicht ermittelt werden.

Tabelle 6.7: Ergebnisse der Bestimmung der hydrodynamischen Radien der biotinylierten Partikel (c=0.09 mg/mL) in Wasser und im serumfreien sowie serumhaltigen Zellkulturmedium RPMI 1640 mit DLS und Vergleich mit den Edukt-Partikel (c = 0.11 mg/mL). T = 296 K.

Biotinylierte Partikel Edukt-Partikel PEG@POS-COOH3b

<Rh>z-1 (H2O) / nm (µ2) 22.2 (0.10) 22.5 (0.09)

<Rh>z-1 (RPMI 1640) / nm

(µ2) 20.5 (0.07) 20.3 (0.12)

<Rh>z-1 (RPMI 1640 + 5

Gew.-% FCS) / nm (µ2) 19 (0.34) 23 (0.34)

Der Einfluss der Funktionalisierung auf die Löslichkeit der Partikel in verschiedenen Medien und auf die Wechselwirkung der Nanopartikel mit den Serumproteinen wurde mittels DLS untersucht. Tabelle 4.1 zeigt die Ergebnisse der DLS-Messungen der

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biotinylierten Partikel und einen Vergleich mit den Edukt-Partikeln PEG@POS-COOH3b. Die Radien der Partikel vor und nach der Biotinylierung in Wasser und in serumfreiem Zellkulturmedium unterscheiden sich kaum voneinander. In Anwesenheit der Serumproteine wird nach der Biotinylierung ein etwas kleinerer Wert ermittelt als vor der Biotinylierung. Auf Grund der niedrigen Konzentration der Nanopartikel, die durch Verdünnung während der Reinigung der Probe mittels Dialyse verursacht wurde, ist die Trennung der Autokorrelationsfunktionen der Nanopartikel und der Serumproteine voneinander nur bedingt möglich, so dass eine leichte Abnahme des Radius detektiert wird. Eine erhöhte unspezifische Adsorption der Serumproteine an die Oberfläche der biotinylierten Partikel, die zur Agglomeration der Partikel führt, kann auf Grund der höheren Empfindlichkeit der DLS gegenüber größeren Teilchen mit hoher Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Adsorption der Serumproteine an die Partikeloberfläche wird demnach -wenn überhaupt- nur wenig von der Biotinylierung beeinflusst.