TFIIIA bindet spezifisch an Karyopherin α1 und α2

4.2 TFIIIA bindet spezifisch an Karyopherin α1 und α2

In den Bindungsstudien wurde mit Transportadapter oder Transportfaktoren beladene GT-Agarose verwendet, um in vitro die Bindung von TFIIIA zu untersuchen. Die erste Analyse zeigte keine Bindung von TFIIIA an Karyopherin β, RanBP7, Transportin oder Karyopherin β3. Neben dem vollständigen Protein wurde die Bindung von verschiedenen TFIIIA-Deletionsmutanten untersucht. Nicht transportkompetente Zinkfinger konnten genausowenig wie auch das in Oocyteninjektionsexperimenten kernlokalisierte 789 Zinkfingerelement an die angebotenen Faktoren binden. Das N-terminale NLS ließ sich in diesem Experiment aufgrund unspezifischer Bindungsaktivität nicht analysieren. Es wurde von allen eingesetzten Transportfaktoren und dem GST-Fusionsanteil gebunden.

TFIIIA und die Deletionsmutante TFIIIA-∆56 zeigen jedoch eine spezifische Affinität zu Karyopherin α1. Dieses Ergebnis korreliert mit Interaktionsstudien, in denen TFIIIA von einem Heteroproteinkomplex bestehend aus Karyopherin α, Karyopherin β und p62 präzipitiert werden kann (Percipalle et al., 1997). Da die Zinkfinger 789 von Karyopherin α1 nicht gebunden werden, ist es wahrscheinlich, dass die Interaktion durch das einzige weitere kernlokalisierungskompetente Zinkfingerelement in seiner Minimalstruktur bestehend aus den Fingern 34 vermittelt wird. Im Kontrollexperiment wurde gezeigt, dass die spezifische Affinität zu α1 erhalten bleibt, wenn TFIIIA-∆56 in immobilisierter Form dem gelösten Transportadapter als Substrat angeboten wird. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Bindung von TFIIIA auf die Karyopherin α1 und α2 Varianten beschränkt ist. Die Varianten α3, α4, und α5 zeigen keine Affinität zu TFIIIA. Dieses Ergebnis korreliert mit der in letzter Zeit häufig diskutierten selektiven Bindungsaktivität einiger Substrate an verschiedene α Karyopherine.

Die selektive Bindung an Karyopherin α1 und α2 konnte nur mit frisch präparierten Komponenten gezeigt werden. Wurden ältere Präparationen von GST-Fusionsproteinen

4. Diskussion

und TFIIIA signifikant gebunden. Es kann nicht davon ausgegangen werden, dass in einer in vitro Situation dieselben Konformationen eingenommen werden wie in vivo. Alle Komponenten mussten frisch präpariert werden, um die selektive Substratbindung der Karyopherin α1 und α2 Varianten darzustellen. Die komplexe in vivo Situation ist in den Interaktionstudien ebenso wenig berücksichtigt wie eine mögliche Konformationsänderung der Karyopherin α Varianten durch Bindung an Karyopherin β.

Karyopherin α abhängiger Import ist in Digitonin permeabilisierten HeLa Zellen mit der Xenopus Karyopherin α2 Variante und verschiedenen anderen humanen α Varianten bereits untersucht worden. Auch in dieser Analyse zeigen bei Verwendung von bei –80°C gelagerten Karyopherin Varianten keine selektive Fähigkeit, den Import von klassischen NLS zu vermitteln, wenn nur ein Importsubstrat angeboten wird. Die Importeffizienz, welche durch die verschiedenen Varianten vermittelt wurde, war jedoch unterschiedlich ausgeprägt.

Wurden verschiedene Importsubstrate angeboten, so war die Importeffizienz, die durch Xenopus Karyopherin α2 von Nukleoplasmin vermittelt wurde, dann am größten, wenn hnRNP K dem Importmix hinzugefügt wurde. Humanes Karyopherin α1 importiert unter diesen kompetitiven Bedingungen zwar hnRNP K effizient, nicht aber Nukleoplasmin (Köhler et al., 1999).

In dieser Analyse ist bei Verwendung von eingefrorenen Karyopherin α Varianten Nukleoplasmin in einer kompetitiven Situation ebenfalls nicht importiert worden. Dieser Befund stützt das in dieser Arbeit ermittelte selektive Bindungsverhalten von frisch präparierten Nukleoplasmin und TFIIIA-∆56 an die Karyopherin α1 und α2 Varianten. Eine selektive Bindung würde auch in Übereinstimung mit den gemeinsamen Expressionsprofilen von TFIIIA und Karyopherin α1 und α2 stehen. Die Problematik des abweichenden Verhaltens unter den verschiedenen in vitro Bedingungen verdeutlicht die Notwendigkeit, in vivo Analysen zur weiteren Aufklärung der selektiven Substratspezifität von den verschiedenen Karyopherin α Varianten durchzuführen. In Experimenten, welche die gezielte Ausschaltung einzelner Karyopherin α Varianten in Oocyten oder dem lebenden Organismus ermöglichen, sollte sich die Redundanz im Bindungsverhalten der Karyopherin Varianten auflösen lassen. Ein gezieltes Ausschalten einzelner Proteine ist z.B. durch Antikörper, RNAi Experimente, Morpholino-Oligonukleotide oder Mutagenese möglich.

Die gezeigte Importkompetenz der 234 Deletionsmutante in HeLa Zellen könnte durch redundante Bindungsfähigkeit an andere Karyopherin Varianten oder weitere bisher noch nicht identifizierte Transportfaktoren erklärt werden. TFIIIA besitzt neben dem transportkompetenten 34 Zinkfingermodul ein weiteres transportaktives Modul, das nicht an

4. Diskussion

Karyopherin α1 binden kann. Die Zinkfinger 789, die in Oocyten und in transienten Transfektionen von HeLa Zellen in den Zellkern importiert werden, könnten ein Transportsignal darstellen, welches dann vom Wildtypprotein genutzt wird, wenn die Karyopherin α1 und α2 Varianten nicht mehr zur Verfügung stehen. In in vitro Importstudien mit HeLa Zellen und Reticulocytenlysat wird das N-terminale NLS, die Zinkfinger 234 nicht aber das C-terminale NLS, die Zinkfinger 789, kernlokalisiert (F. Rudt, persönliche Mitteilung). Der auftretende Widerspruch zu den Ergebnissen der transienten Transfektionen von HeLa Zellen, in denen auch das 789 Zinkfingerelement kernlokalisiert wird, kann durch die unterschiedliche Dauer der für die Transportprozesse zur Verfügung stehenden Zeit erklärt werden. Die transfizierten HeLa Zellen wurden zwei Tage in Kultur gehalten. In den in vitro Importstudien ist der Transportprozeß nach 30 min abgebrochen worden. Die Ergebnisse, die unter den restriktiveren Bedingungen der in vitro Importstudien vorliegen, korrelieren mit den Interaktionsstudien dieser Arbeit. In HeLa Zellen ist dem 789 Zinkfingerelement aufgrund der in vitro Importstudien keine biologische Relevanz zuzuordnen. In Oocyten kann eine biologische Funktion aufgrund der Summe der importierten Deletionsmutanten nicht ausgeschlossen werden.

Da das C-terminale NLS 789 nicht mit Karyopherin α1 interagiert, ist es möglich, dass die Interaktion von TFIIIA mit Karyopherin α (siehe 3.5.3) auf das einzige weitere transportaktive Element von TFIIA, die transportaktiven Zinkfinger 34, zurückzuführen ist.

Das mit basischen Aminosäuren angereicherte Zinkfingermodul des N-terminalen NLS, nicht aber das mit basischen Aminosäuren angereicherte Zinkfingermodul des C-terminalen NLS überlappt mit den Zinkfingern, die wesentlich an der 5S RNA Bindung von TFIIIA beteiligt sind.

Für das C-terminale NLS wurde in verschiedene Deletionsmutanten eine Kernlokalisierungs-kompetenz in Oocyten gezeigt. In transfizierten HeLa Zellen ist das 789 Zinkfingerelement kernlokalisiert. In der Sequenz des neunten Zinkfingers sind mehrere basische Aminosäuren enthalten. Eine der aktuellen Theorien zum nukleocytoplasmatischen Transport geht von der Notwendigkeit aus, dass hydrophile Proteinoberflächen durch die Bindung an Transportfaktoren verdeckt sein müssen, um Kerntransport zu ermöglichen (Ribbeck und Görlich, 2001). Eine Beteiligung weiterer Faktoren oder eine andersartige Maskierung der 789 Zinkfinger während des Transports in Oocyten wäre also eine Vorraussetzung für die Kernlokalisierung von TFIIIA. Dieser hydrophobe Zustand sollte auch im Karyopherin α/β

4. Diskussion

und gelösten Transportfaktoren könnte Aufschluss darüber geben, welche der beiden Zinkfingerelemente den Kontakt zu Karyopherin α herstellen.