Maschinelle „Whole mount“ in situ Hybridisierung

Die maschinelle „Whole mount“ in situ Hybridisierung wurde das Insitu pro Gerät von Abimed verwendet. Die Maschine besteht aus einem Reservoirschlauch, der an einer Hebelpumpe mit vorgeschaltetem Verteilerelement angeschlossen ist. Über den Schlauch werden Flüssigkeiten aufgenommen und über eine doppelwandige Nadel in das Inkubationsgefäß, in dem sich die Embryonen befinden, gegeben. Die Inkubationsgefäße tauchen mit einer nadelförmigen Verlängerung in ein flüssigkeitsgefülltes Sammelbecken ein (zu Beginn mit Wasser gefüllt). Durch den Wasserdruck wird die Füssigkeit im Inkubationsgefäß gehalten. Das Sammelbecken ist mit einem Überlaufabfürungsschlauch versehen, der in einem Abfallsammelgefäß mündet. Soll ein Wechsel der Inkubationslösung erfolgen, wird die Lösung aus dem entsprechenden Vorratsgefäß in den Reservoirschlauch gesaugt, das Reaktionsgefäß mit dem Roboterarm angesteuert, die im Gefäß vorhandene Flüssigkeit über Luftzufuhr durch die äußere Nadel und den so entstehenden Überdruck nach unten in das Sammelbecken ausgeblasen. Die äußere Nadel schließt mit der Öffnung der Inkubationsgefäße ab. Die innere längere Nadel hat einen geringeren Durchmesser, so dass über sie definierte Flüssigkeitsmengen in den Inkubationsraum gegeben werden können. Da die Embryonen sehr fragil sind, wird zunächst eine geringe Flüssigkeitsmenge mit niedrigem Druck in das Inkubationsgefäß gegeben. Sind die Embryonen vollständig bedeckt, kann das Gefäß mit höherem Druck bis zum angestrebten Volumen gefüllt werden. Um den Temperaturbereich für Hybridisierungsreaktionen einstellen zu können, sind die Inkubationsgefäße in einen Heizblock mit 8 mal 12 Vertiefungen eingefasst. Die Steuerung von Hebelpumpe, Heizblock und Roboterarm erfolgt über eine vom Hersteller mitgelieferte Software (Abimed in situ Software 4.0), die entweder über eine zum Gerät gehörende DOS basierte Steuerkonsole oder über eine Windows basierte Eingabeoberfläche angepasst werden kann.

Vor Benutzung des Gerätes wurde frisches, destilliertes Wasser in das Vorratsgefäß für Spülschritte gegeben. Wurde die Anlage längere Zeit nicht benutzt, erfolgte eine Reinigung des Systems mit 3 % Wasserstoffperoxidlösung und zweimaligem Spülen mit frischem, destilliertem Wasser unter Verwendung eines Herstellerprogramms. Vorrats- und

2. Material und Methoden

Inkubationsgefäße wurden bei erstmaliger Benutzung mit 3 % Wasserstoffperoxidlösung und zweimaligem Spülen mit frischem, destilliertem Wasser gereinigt. Nach Verwendung in einer

„whole mount“ in situ Hybridisierungsprozedur wurden die Gefäße 5 x mit deionisiertem Wasser gespült und anschließend zur Inaktivierung möglicher RNase Kontaminationen für 24 Stunden in 0,1 N Natronlauge eingelegt. Nachdem die Natronlauge durch fünfmaliges Spülen mit deionisiertem Wasser vollständig entfernt wurde, erfolgte eine weitere Spülung mit 3 % Wasserstoffperoxidlösung. Anschließend wurde verbleibende Flüssigkeit durch dreimaliges Waschen der Gefäße mit technischem Ethanol entfernt und die Gefäße bei 80°C für 30 bis 60 Minuten getrocknet.

Für die maschinelle „whole mount“ in situ Hybridisierung wurden bei –20°C gelagerte prähybridisierte Embryonalstadien wie unter 2.2.8.3 beschrieben verwendet. Der Transfer der Embryonen in die Inkubationsgefäße erfolgte mit einer aufgeschmolzenen Pasteurpipette in Prähybridisierungslösung. Anschließend wurde nach folgendem exemplarischem Programm verfahren:

2. Material und Methoden

Schritt Funktion Aktion Erklärung

1 SetTempReg T0 (OFF) Heizblock der Gefäßhalterung aus 2 Rinse 5000 / 5000 µl Spülen des Reservoirs mit 5 ml dH2O 3 SetTempReg T2 (HIGH) Erhitzen der Gefäßhalterung auf 65°C

4 Incubate 1 h 150 C-SAMPLE_A Wechseln der Hybridisierungslösung 150 µl und Inkubation für 1h

5 Incubate 16 h 150 Probe-SAMPLE_A Inkubation mit der RNA Sonde 150 µl für 16h

6 Incubate 15 min 150 C-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl Hybridisierungslösung und Inkubation für 15 min

7 Incubate 15 min 150 D-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl 2 x SSC und Inkubation für 15 min 8 Incubate 20 min 150 D-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl 2 x SSC und Inkubation für 20 min 9 Incubate 20 min 150 E-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl 0,2 x SSC und Inkubation für 20 min 10 Incubate 20 min 150 E-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl 0,2 x SSC und Inkubation für 20 min 11 SetTempReg T0 (OFF) Heizblock der Gefäßhalterung aus

12 Wait 20 min Abkühlen des Heizblocks der Gefäßhalterung auf RT 13 Incubate 15 min 150 A-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl MAB-Puffer und Inkubation für 15 min 14 Incubate 15 min 150 A-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl MAB-Puffer und Inkubation für 15 min 15 Incubate 20 min 150 A-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl MAB-Puffer und Inkubation für 20 min 16 Incubate 60 min 150 L-SAMPLE_A Abdecken unspezifischer Bindungsstellen mit 150 µl

Block-Lösung und Inkubation für 1h 17 Incubate 6 h 150 M-SAMPLE_A Antikörperinkubation mit 150 µl für 6h

18 Incubate 20 min 150 A-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl MAB-Puffer und Inkubation für 20 min 19 Incubate 20 min 150 A-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl MAB-Puffer und Inkubation für 20 min 20 Incubate 20 min 150 A-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl MAB-Puffer und Inkubation für 20 min 21 Incubate 40 min 150 A-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl MAB-Puffer und Inkubation für 40 min 22 Incubate 40 min 150 A-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl MAB-Puffer und Inkubation für 40 min 23 Incubate 40 min 150 A-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl MAB-Puffer und Inkubation für 40 min 24 Incubate 60 min 150 A-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl MAB-Puffer und Inkubation für 60 min 25 Incubate 60 min 150 A-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl MAB-Puffer und Inkubation für 60 min 26 WaitForKey APB in Position F Vorratsgefäß mit frischem APB-Puffer auf Position F

Stellen und Programm fortsetzen

27 Incubate 15 min 150 F-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl APB-Puffer und Inkubation für 15 min 28 Incubate 15 min 150 F-SAMPLE_A Waschen mit 150 µl APB-Puffer und Inkubation für 15 min 29 Rinse 5000 / 5000 ul Spülen des Reservoirs mit 5 ml dH2O

30 SetTempReg T0 (OFF) Ende des Programms

Tabelle 7 : Exemplarisches Programm für eine maschinelle „whole mount“ in situ Hybridisierung.

Spalte eins gibt den jeweiligen Programmschritt an. In Spalte zwei ist die aufgerufene Funktion aufgelistet. Hier bedeutet SetTempReg: Ansteuerung des Temperaturreglers der Heizplatte, Rinse:

Spülvorgang ohne Ansteuerung von Inkubationsgefäßen, Wait: Warteposition für einen bestimmten Zeitraum, WaitForKey: eine Tastatureingabe ist zur Programmfortführung notwendig, Incubate: Wechsel der Inkubationslösung. In Spalte drei ist die auszuführende Aktion in Folgender Reihenfolge aufgelistet:

Zeit in Minuten oder Stunden, das hinzugefügte Volumen der Inkubationsflüssigkeit, die Position des Vorratsgefäßes der Puffer (A, C, D, E, F, oder Probe), die anzusteuernden Proben (hier wurde nur ein Bereich von 1-96 Inkubationsgefäßen definiert) in dem jeweiligen Programmschritt. In Spalte vier ist eine kurze Erklärung der jeweiligen Programmschritte aufgelistet. Die verwendeten Lösungen sind anhand ihrer Positionsangabe unten aufgelistet.

2. Material und Methoden

Lösungen für "whole mount" in situ Hybridisierung:

A: MAB-Puffer (Maleinsäurepuffer):

500 ml 5 x Stock 1 L Maleinsäure 100 mM 5,8 g 58 g NaCl 150 mM 4,4 g 44 g pH 7,5

D: 2 x SSC E: 0,2 x SSC

F: APB-Puffer (Alkalischer Phosphatase Puffer):

Tris-HCl pH 9,5 100 mM 50 ml Tris 1M MgCl2 50 mM 25 ml MgCl2 1M NaCl 100 mM 10 ml NaCl 5M Tween 20 0,1 % 2,5 ml 20 % Tween

ad 500 ml pH 9,5; bei 4°C maximal 14 Tage aufbewahren

L: Block-Lösung: MAB + 2 % BMB + 20 % Pferde-Serum

1 Teil 5 x MAB + 1 Teil 10 % BMB + 1 Teil Serum + 2 Teile H2O (6,6 ml 5 x MAB + 6,6 ml 10 % BMB + 6,6 ml Serum + 13,2 ml H2O = 33 ml)

M: Anti Digoxygenin- oder Fluorescin-Antikörper: 15 ml Block-Lösung + 3 µl AK (1/5000) C: Hybridisierungs-Lösung:

Formamid 50 % 500 ml deionisiert (BRL 5515UB) SSC 5 x 250 ml 20 x Stock-Lsg.

Torula RNA 1 mg/ml 20 ml 50 mg/ml Stock-Lsg. (SIGMA R6625) Heparin 100 µg/ml 100 mg 10 mg /ml (Sigma H-9399)

Denhart´s 1 x 1 ml 100 x Stock-Lsg.

Tween-20 0.1 % 1 g 20 % Stock-Lsg. (Sigma P-1379) CHAPS 0.1 % 1 g Einwaage (Sigma C-3023) EDTA 10 mM 20 ml 0.5 M-Stock-Lsg. (MW 292,2)

DEPC-H2O ad 1 L

Die Hybridisierungslösung wurde bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.

Probe: Digoxygenin oder Fluorescin markierte RNA-Sonde: 20 µl RNA Probe (in Formamid, H2O 1:1) 150 µl Hybridisierungslösung

RNasen: 20 µg/ml RNase A, 10 U/ml RNase T1 (manuelle „whole mount“ in situ Hybridisierung)

3. Ergebnisse

3 Ergebnisse