Die Synthese und Untersuchung der modifizierten ON erfolgte in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Dr. C. Höbartner (MPI für Biophysikalische Chemie, Göttingen).
Dabei wurde auf die bereits in der Vorarbeit erfolgreich angewendete Phosphoramidit-Methode nach Beaucage und Caruthers zurückgegriffen.[9] Das Grundprinzip dieses Verfahrens besteht in der Kupplung von aktivierten Nucleosid-Derivaten an Träger-gebundene Mono- oder Polynucleotide durch periodische Reaktionszyklen, die jeweils vier Schritte beinhalten (Abb. 4.27). Das Kettenwachstum erfolgt in diesem Prozess in 3’→5’-Richtung.
Abb. 4.27: Der Reaktionszyklus der ON-Synthese (das Capping in Schritt 4. ist im Sinne der Übersichtlichkeit nicht dargestellt).
1. Ein Reaktionszyklus beginnt mit der Entfernung der in der 5’-Position befindlichen DMTr-Schutzgruppe durch Spülen des Trägers mit der Lösung einer mittelstarken Säure. Hierfür wurde in dieser Arbeit 3% Dichloressigsäure (DCA) in Dichlorethanol
(DCE) oder 3% Trichloressigsäure (TCA) in Dichlormethan verwendet. Durch die niedrige Konzentration der Säure sollten Nebenreaktionen wie etwa die Spaltung der N-glykosidischen Bindung vermieden werden.
2. Es folgt die Bildung eines Phosphit-Triesters durch Reaktion der entschützten 5’-Hydroxygruppe und einem aktivierten Phosphoramidit-Reagenz 161 (Abb. 4.27), das in gelöster Form zur Matrix gegeben wird. Wie in den gängigen Verfahren üblich, waren alle Phosphoramidit-Reagenzien in Acetonitril gelöst. Die Aktivierung des Reagenzes 161 erfolgt durch schwache Säuren. Hierfür wurde das im Gegensatz zum Tetrazol weniger explosionsgefährliche Benzylthiotetrazol (BTT) eingesetzt. Als Schutzgruppe der Phosphittriester wurde die von Köster eingeführte, mild-alkalisch abspaltbare (β-Eliminierung) β-Cyanoethylgruppe verwendet.[124]
3. Die gebildete Phosphit-Triestereinheit wird durch Oxidation in eine Phosphat-Triestereinheit überführt. Zu diesem Zweck wurde eine wässrige, leicht alkalische Iod-Lösung verwendet (Iod in Pyridin/H2O oder Iod in abs. MeCN/2,4,6-Collidin/H2O).
4. Abschließend werden restliche nicht umgesetzte Monomere oder Stränge an der festen Phase an der reaktiven 5’-Hydroxygruppe acetyliert (Capping). Auf diese Weise soll die Bildung von Nebenprodukten unterdrückt werden. Hierzu wurde von mild alkalischen Acetylierungsmethoden (Ac2O, 1-Methylimidazol, Pyridin in THF oder Ac2O, DMAP, 2,4,6-Collidin in MeCN) Gebrauch gemacht.
Unter Verwendung dieser Methode sind die in Kap. 3.2.1.1 angeführten 24 NAA-modifizierten ON synthetisiert worden. Die NAA-Modifikationen wurden an den vorgesehenen Positionen innerhalb der jeweiligen Sequenz durch Einsetzen der Reagenzien (6’S)- oder (6’R)-69 (Abb. 4.20) anstelle von 161. Kupplungen der Reagenzien 69 verliefen laut Trityl-Monitoring stets schlechter als diejenigen von Phosphoramiditen gewöhnlicher Nucleoside. Daher resultierten bei der Synthese der NAA-modifizierten ON oft kürzere Stränge als Nebenprodukte. Dies wurde durch die Beobachtungen bei der Reinigung der ON bestätigt (s.u.). Nach abgeschlossener Synthese wurden die ON durch alkalische Hydrolyse des Linkers von dem Träger abgespalten. Hierzu wurde der noch beladene Träger in einer 3:1-Mischung aus wässriger Ammoniaklösung (25%) und Ethanol für 20 h bei 55 °C inkubiert. Bei diesem Vorgang ist eine Epimerisierung der chiralen NAA-Gruppen aufgrund der Acidität des α-Protons denkbar. Um zu überprüfen, ob tatsächlich eine Epimerisierung stattgefunden hat, wurde die Verbindung (6’S)-146 den Bedingungen der Abspaltung vom Träger ausgesetzt (Abb. 4.28).
Abb. 4.28: Kontrollversuch zur möglichen Epimerisierung von NAA-Einheiten.
Das auf diese Weise erhaltene Produkt konnte auf Basis von NMR-spektroskopischen und massenspektrometrischen Untersuchungen zweifelsfrei als (6’S)-162 identifiziert werden (Abb. 4.28). Damit wurde der Beweis erbracht, dass unter den Bedingungen der Abspaltung vom Träger keine Epimerisierung der NAA-Einheiten stattfindet. Durch Messung der UV-Absorption der erhaltenen wässrigen Lösungen der Rohprodukte wurden die Ausbeuten der ungereinigten ON bestimmt (s. Kap. 7.2.6.1, Tab. 1). Die Ausbeuten liegen in den meisten Fällen im Bereich zwischen 20% und 40%, wobei einige der höchsten Ausbeuten bei ca. 70% liegen.
Insgesamt wurden unter Verwendung von CPG (controlled pore glass) als Trägermaterial etwas höhere Werte erhalten als im Fall der alternativ verwendeten Polystyrolmatrix. Es folgte die Reinigung der ON per Gelelektrophorese. Das hierzu verwendete Gel wurde durch Polymerisation von Acrylamid (Initiator:
Ammoniumperoxodisulfat (APS)) in gepufferter wässriger Lösung (Tris-Borsäure-Puffer, pH = 8) hergestellt. Für jede Trennung wurden 40 nmol des ungereinigten ON sowie ein Indikatorgemisch, das der Visualisierung des Verlaufs der Elektrophorese diente, auf das Elektrophoresegel aufgetragen. Nach Ablauf der Elektrophorese wurden die ON-haltigen Segmente anhand ihrer UV-Aktivität sichtbar gemacht.
Hierbei wurden insbesondere bei mehrfach NAA-modifizierten ON Banden von Nebenprodukten, die als Folge der geringeren Reaktivität der Phosphoramidit-Reagenzien 69 (Abb. 4.20) entstanden waren, beobachtet (Abb. 4.29).
ON 7 5'-GGCACGG TxT TT TT TT GGCACGG-3', σ(x): S ON 9 5'-GGCACGG TxT TxT TxT TxT GGCACGG-3', σ (x): S ON 19 5'-G TxT GACG TxT GACG TxT GACG TxT G-3', σ (x): S ON 20 5'-G TxT GACG TxT GACG TxT GACG TxT G-3', σ (x): R
x = NAA-Modifikation, σ(x): NAA-Konfiguration
Abb.4.29: Bilder der Banden in den Gelen der ON 7, 9, 19 und 20.
Da das Trennprinzip der Elektrophorese auf Größenausschluss durch die Poren des Polyacrylamid-Netzwerks beruht, konnte davon ausgegangen werden, dass die Bande mit dem kürzesten zurückgelegten Weg das Hauptprodukt darstellt. Diese Bande wurde ausgeschnitten und mit einer wässrigen gepufferten Salzlösung (TEN-Puffer, pH = 8) extrahiert. Die ON wurden schließlich durch eine Ethanolfällung in reiner Form erhalten. Die Korrektheit der ON-Synthese wurde durch massenspektrometrische Untersuchungen bei allen 24 synthetisierten ON bestätigt (s. Tab. 2, Kap. 7.2.6). Alle ON wurden durch HPLC-Untersuchungen auf ihre Reinheit geprüft (Chromatogramme, s. Kap. 9.1.2.1). Die Ausbeuten der ON nach der Reinigung (s. Kap. 7.2.6. Tab. 1) lagen in den meisten Fällen im Bereich zwischen 20% und 50%. Es ist auffällig, dass ON mit vier NAA-Modifikationen die niedrigsten Ausbeuten aufweisen. Die Erklärung hierfür sind die bereits erwähnten Verluste durch bei der ON-Synthese gebildete Abbruchfragmente. Aus sämtlichen experimentellen Befunden wurden keine Hinweise auf Nebenreaktionen der entschützten 6’-Aminogruppen mit Acrylnitril erhalten.
ON 19 ON 20
ON 9 ON 7