Synthese der PUG-Repetiereinheit und optimierte SPPS

Im Vergleich zur klassischen Festphasenpeptidsynthese, bei der jede Aminosäure einzeln gekuppelt wird, bietet sich für die Synthese von Kollagenen die Kupplung von Peptidfragmenten an, welche bereits von P^ROCKOP et al. im Jahr 1972 erstmals beschrieben wurde.[187, 194]

Dabei werden im Falle von Kollagen-Modellpeptiden entsprechend geschützte Pro-Hyp-Gly-Fragmente gekuppelt bis das gewünschte Peptid aufgebaut ist. Auch Synthesen mit Gly-Pro-Hyp-Fragmenten sind bekannt.^[195]

Die Synthese mittels Fragmentkupplung löst dabei mehrere Probleme. Zum einen weist das 4-Hydroxyprolin eine stark verringerte Acylierbarkeit in der SPPS auf, welche zu einer Vielzahl von Deletionsmutanten führen und damit die Ausbeute massiv verringern würde.^{[63, 188]} Dieser Nachteil wird dabei auf die Ebene der Fragmentsynthese verschoben. Zum anderen führt die Kupplung von Pro-Hyp-Gly-Fragmenten zu einer deutlich verringerten Anzahl an Kupplungsschritten. Außerdem führt eine Fehlkupplung immer zur selben, um eine Repetiereinheit verkürzten, Sequenz, was eine abschließende Reinigung des Rohprodukts erheblich vereinfacht. Basierend auf früheren Arbeiten der Arbeitsgruppe wurde die Synthese des Tripeptidfragments 7, welches für die SPPS geeignet, ist in 7 Stufen dargestellt (Schema 7).[196, 197]

Ausgangspunkt der Synthese sind dabei Hydroxyprolin und Glycin.

Schema 7: Synthese des für die SPPS geeigneten Tripeptidfragments 7 über 7 Stufen.^{[196, 197]} (i) Boc2O, NaOH, THF/H2O, 16 h, RT; (ii) BnOH, pTsOH, Toluol, 19 h, reflux; (iii) HBTU, HOBt, DIPEA, DMF, 20 h, RT; (iv) TFA, 2 h, RT; (v) Fmoc-Pro-OH, HBTU, HOBt, DIPEA, DMF, 20 h, RT; (vi) Isobuten (8% in DCM), H2SO4, 7 d, RT; (vii) H2 (10 bar), Pd/C (5%), 66 h, RT.

Wie in Schema 7 deutlich zu sehen ist, sind es zwei Transformationen, welche die Synthese des SPPS-Bausteins 7 limitieren. Zum einen die Peptidkupplung in Lösung zum Tripeptid 5 mit einer Ausbeute von 54% und zum anderen die Bildung des tert-Butylethers 6 in einer moderaten Ausbeute von 71% aber mit einer Reaktionszeit von sieben Tagen. Acylierungen von Hydroxyprolin-Derivaten sind fast immer mit schlechten bis moderaten Ausbeuten verbunden, was dazu führt, dass alle etablierten Synthese zum SPPS-Baustein 7 oder ähnlichen Derivaten den Schritt der Acylierung entweder möglichst an den Anfang der Synthese stellen oder aber die schlechte Ausbeute durch eine verringerte Stufenzahl kompensieren.[63, 196–198]

Den Schritt mit der größten zeitlichen Limitierung stellt allerdings die Bildung des tert-Butylethers mit einer Reaktionszeit von sieben Tagen dar. Eine Optimierung der bisherigen Reaktionsbedingungen ausgehend von Isobuten wurde jedoch als wenig zielführend erachtet da die besten Ausbeuten mit einer 24%igen Isobutenlösung in DCM, hergestellt aus einkondensiertem Isobuten, erreicht wurden.[196, 197]

Das Benutzen einer 8%igen Isobutenlösung in DCM führte in allen Fällen zu geringeren Ausbeuten, was die Isobutenkonzentration als einen kritischen Parameter

erscheinen lässt. Zum gewünschten Ergebnis führte dabei eine Methode zur Bildung von tert-Butylethern von SAMBRI et al.. Dabei gelang es, eine Vielzahl von Strukturell sehr unterschiedlichen Alkoholen mittels Boc2O und Mg(ClO4)2 in guten bis sehr guten Ausbeuten und milden Reaktionsbedingungen in die entsprechenden tert-Butylether zu überführen.^[199] Die Reaktionsbedingungen ließen sich dabei auf Alkohol 5 übertragen wobei durch eine Erhöhung der Äquivalente von Boc2O eine nahezu quantitative Ausbeute bei einer Reaktionszeit von 14 Stunden tert-Butylether 6 erhalten werden konnte. Die bisherigen und optimierten Reaktionsbedingungen, sowie Ausbeuten der Umsetzung zu 6 sind in Tabelle 6 aufgeführt. Angemerkt sei dabei, dass sich DCM Lösungen mit einem Isobutenanteil bis maximal 8%

kommerziell erhältlich sind (Eintrag 2). Sind höhere Isobutenkonzentrationen notwendig, muss eine entsprechende Lösung durch Einkondensieren von gasförmigen Isobuten hergestellt werden (Eintrag 1).

Tabelle 6: Verschiedene Reaktionsbedingungen für die Umsetzung zum tert-Butylether 6.

Eintrag Lösungsmittel Reagenzien Reaktionszeit Temp. Ausbeute

1^[196] DCM 1,20 Äq Isobuten

(24% in DCM) 0,80 Äq H2SO4

7 d RT 71%

2 DCM 4,80 Äq Isobuten

(8% in DCM) 0,80 Äq H2SO4

7 d RT 61%

3 DCM 5,00 Äq Boc2O

10 mol% Mg(ClO4)2

5 h 40 °C Kein

Umsatz 4 Boc2O/DCM

2:1

50,0 Äq Boc2O 35 mol% Mg(ClO4)2

14 h 40 °C 99%

Die SPPS, in welcher der Tripeptid-Baustein 7 eingesetzt wurde, lässt sich in einer großen Zahl von Parametern variieren. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit des Bausteins 7 ist eine systematische Variation einzelner Parameter nicht zielführend.

Stattdessen wurde versucht, durch gezielte Variation einzelner Parameter ausgehend von bekannten SPPS-Protokollen die Effizienz der SPPS, also höhere Ausbeuten bei verringertem Einsatz des Tripeptid-Bausteins 7, zu erreichen.[63, 196, 198] Da für die SPPS von Kollagen-Modellpeptiden die Aggregation auf dem polymeren Träger den größten Anteil an schlechten Ausbeuten zu haben scheint, wurde das unterdrücken dieser Aggregation als essenziellste Voraussetzung für eine effiziente Synthese angesehen. Als polymerer Träger für die SPPS wurde dabei ein Rink-Amid-Harz gewählt, da man nach saurer Abspaltung direkt das gewünschte C-terminale Carboxamid erhält.[198, 200]

Dabei wurde die Beladung möglichst klein gewählt (0,35 mmol/g), um Aggregation auf dem polymeren Träger zu verhindern.

Des Weiteren wurde die Temperatur für Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe und Kupplung von Tripeptideinheiten auf 70 °C erhöht, da bekannt ist, dass eine Erhöhung der Temperatur zu einer deutlich verkürzten Kupplungszeit führt, ohne die Reinheit oder Ausbeute zu beeinflussen.^[201–203] Darüber hinaus wurden im Arbeitskreis bereits gute Erfahrungen mit DMSO als Lösungsmittel bei der Synthese von Peptiden, welche zur Aggregation neigen, gemacht.^[202] Daher wurde zum Abspalten der Fmoc-Schutzgruppe eine 30%ige Piperidinlösung in DMSO mit dem Zusatz von 1% Triton X-100 verwendet. Für die Kupplung wurden HATU und HOAt sowie DIPEA als Base verwendet. Als Lösungsmittel diente ein Lösungsmittelgemisch als Toluol und DMSO im Verhältnis 3:1. Außerdem wurde die zu kuppelnde Aminosäure 10 min bei Raumtemperatur voraktiviert, bevor die eigentliche Kupplung am polymeren Träger für 30 min bei 70 °C durchgeführt wurde.

Durch diese Optimierungen des SPPS-Protokolls war es dabei nicht nur möglich Ausbeute sowie Reinheit des Rohpeptides zu erhöhen, sondern auch die benötigte Menge Fmoc-geschützten Bausteins 7 deutlich zu reduzieren. In Tabelle 7 sind gängige Bedingungen für die Kollagensynthese mittels SPPS und deren Ausbeuten sowie Reinheiten aus der Literatur der hier beschriebenen gegenübergestellt. Die Daten beziehen sich alle auf die Kupplung von sieben Tripeptideinheiten zur entsprechenden (PUG)7-Einheit.

Tabelle 7: Gegenüberstellung verschiedener Bedingungen für die Kupplung von sieben Tripeptideinheiten mittels SPPS.

Parameter\Eintrag 1^[196] 2^[198] 3

Baustein 4,0 Äq. 7 4,5 Äq.

Fmoc-PU^TBDPSG-OH

2,0 Äq. 7

Reagenzien 4,0 Äq HBTU

20 Äq DIPEA

4,5 Äq. HCTU

13,5 Äq. DIPEA

3,0 Äq. HATU 3,0 Äq. HOAt 6,0 Äq. DIPEA

Lösungsmittel DMF DMF Toluol/DMSO 3:1

Temperatur RT RT 70 °C

Zeit 30 min 90 min 30 min

Fmoc-Abspaltung 25% Piperidin in DMF

40% Piperidin in DMF 30% Piperidin in DMSO + 1% Triton X-100

Temperatur RT RT 70 °C

Zeit 15 min 13 min 20 min

Rohpeptid^a 12 mg 34 mg 49 mg

Reinheit^b n.b. 60% 79%

Ausbeute^c n.b 12% 25%

aBezogen auf einen 0.05mM Ansatz. ^bBetimmt mittels RP-HPLC aus dem Rohpeptid. ^cNach Reinigung mittels semi-präparativer RP-HPLC

Neben der Synthese des SPPS-kompatiblen Fragments 7 und der Kupplung der Tripeptidfragmente auf dem polymeren Trägermaterial ist die Reinigung des Rohpeptids mittels semipräparativer RP-HLPC von essenzieller Bedeutung für die Ausbeute, aber vor allem auch die Reinheit des Peptides. Gegenüber der analytischen RP-HPLC ergebenen sich für die semipräparative Reinigung eine Reihe von Änderungen. Zum einen ist der Druck deutlich geringer (120 bar statt 400 bar) bei gleichzeitiger Erhöhung des Durchflusses (7,5 mL/min statt 0,45 mL/min). Zum anderen ist die Konzentration des zu Reinigenden Peptids deutlich höher (5-20 mg/mL). Das bei weitem größte Problem bei der Reinigung von Kollagen-Modellpeptiden ist allerdings die Bildung der charakteristischen Tripelhelix bzw. höheren Aggregaten. Dies führt zu einer deutlichen Verbreiterung der Peaks was eine Reinigung, also dem Abtrennen von Verunreinigungen, erschwert oder sogar die Isolation eines Peptids mit hoher Reinheit, unmöglich macht. Hieran wird

noch einmal deutlich, warum bereits eine Optimierung des SPPS-Protokolls und damit eine Synthese von Peptiden mit möglichst hoher Reinheit auf Stufe des Rohpeptids, sowie eine Minimierung möglicher Nebenprodukte für die nachfolgende Reinigung von großer Bedeutung ist. Da die Bildung der Tripelhelix thermisch reversibel verläuft, erschien eine Reinigung der Rohpeptide bei erhöhter Temperatur am vielversprechendsten. Da für die zur Verfügung stehende semipräparative RP-HPLC kein Säulenofen verfügbar war, wurde die Säule mit Hilfe eines Wasserbades erhitzt. Das führte zu einer Temperatur zwischen 45 °C und 55 °C, also im Mittel von 50 °C. Zu beachten ist jedoch, dass durch die erhöhte Temperatur der Druck infolge der geringeren Viskosität abnimmt, was die Trennleistung potentiell negativ beeinflussen kann.[204, 205]

Letztlich ließ sich durch erhöhen der Temperatur eine deutlich verbesserter Trennleistung für Kollagen-Modellpeptide erreichen.

Während bei Raumtemperatur keine ausreichende Abtrennung der Nebenprodukte erreicht werden konnte, was nur zu kleinen Mengen Peptid mit ausreichender Reinheit (≥95%) führte, ließen sich durch erhöhen der Temperatur auf etwa 50 °C grundliniengetrennte Peaks erhalten und damit alle Verunreinigungen abtrennen.

(Abbildung 9)

Abbildung 9: Chromatogramme aus der semipräparativen Reinigung von 10 mg Kollagen-Modellpeptid. Links:

Chromatogramm bei RT mit nicht vollständig getrennte Peaks. Dies führt zu Produktfraktionen mit niedriger Reinheit, da das Nebenprodukt nicht ausreichend abgetrennt werden kann Rechts: Chromatogramm bei 50 °C mit grundliniengetrennten Peaks. Dies führt zu Produktfraktionen mit hoher Reinheit. Chromatographische Bedingungen: 7,5 mL/min, 2–30% B in 60 min, A = Wasser + 0,1% TFA, B = Acetonitril + 0,085% TFA.

Mit den Optimierungen der Bausteinsynthese, des SPPS-Protokolls, sowie der

Reinigung des Rohpeptids, gelang es das Referenz Kollagen-Modellpeptid Ac-(PUG)7-NH2 (8) in einer hohen Gesamtausbeute mit hervorragender Reinheit

darzustellen. Dabei stellt die drastische Reduktion des benötigtem

Tripeptid-Bausteins 7 in Kombination mit einer optimierten Synthese, welche zu stark erhöhten Ausbeuten nach semipräparativer Reinigung führt, im Vergleich zu etablierten Methoden eine beachtliche Weiterentwicklung dar.^{[63, 198]}