Synthese der cycloSaligenyl-Hexosemonophosphate

4.2.2.3 Synthese der cycloSaligenylchlorphosphite

Die Umsetzung der Salicylalkohol-Derivate 24a-e zu den cyclischen Saligenyl-chlorphosphiten 97a-e (Abb. 82) erfolgte mit 1.2 Äquivalenten Phosphor(III)-Chlorid unter Zugabe von 2.3 Äquivalenten Pyridin als Base in Diethylether bei einer Temperatur von –20 °C.¹⁵⁰

OH X OH

O

X O P

Cl PCl₃, Et₂O

2.5 h, -20 °C Rt, [Ar]

24a-e 97a-e

X = H (a); 3-Me (b); 5-Cl (c); 5-tButyl (d); 3,5-Di-tbutyl (e) Abb. 82: Darstellung der cycloSaligenylchlorphosphite

Das bei der Reaktion ausfallende Pyridinhydrochlorid ließ sich durch Filtration abtrennen.

Anschließendes Abkondensieren des Lösungsmittels lieferte Öle, in seltenen Fällen Feststoffe, als Rohprodukte. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Saligenylchlorphosphite, vor allem gegenüber Feuchtigkeit, kam eine Aufreinigung dieser Rohprodukte nicht in Frage. Sie wurden deshalb direkt als phosphitylierende Agentien in den nachfolgenden Synthesen der cycloSal-HMP eingesetzt und waren bei –20 °C über mehrere Monate haltbar.

Lösungsmittels und chromatographischer Aufreinigung konnten die gewünschten cycloSal-HMPs als farblose Feststoffe erhalten werden (Abb. 83).

O OR

RO O

P O O O

1

3 5

32a-e, I-V O

X O P

Cl

97a-e

O OR

RO OH

78, 79, 83, 87, 88, 91, 93

+ 1) ACN, DIPEA, -20 °C

2) tBuOOH, -20 °C 1 h,[Ar]

Rt Rt

X

R = Ac (I); Bz (II); Lev (III); THP (IV); pMb (V);

X = H (a); 3-Me (b); 5-Cl (c); 5-tButyl (d); 3,5-Di-tbutyl (e)

O O

36a-c O

X O P

Cl

97a-c

O OH

OR

96

+ 1) ACN, DIPEA, -20 °C

2) tBuOOH, -20 °C 1 h,[Ar]

Rt Rt RORO

RO

OR P

O O

O X

RORO RO 33a-d, I-II

Abb. 83: Darstellung der cycloSaligenyl-Hexosemonophosphate

Die Darstellung von bis-[p-AB]-ManMP 34 und bis-[o-AB]-ManMP 35 wurde entsprechend der Phosphoramidit-Methode (Kap. 3.2.2.2, S. 41) durchgeführt (Abb. 84).

O O P

O O AcO O

AcO AcO O

Ac N P OO

OH AcO O

AcO AcO O

Ac

50b, 52b 34, 35

78

+ 1) d4T, 1H-Tetrazol, ACN, Rt, 2-3 h, [Ar]

2) t-BuOOH, -40 °C,1 h, [Ar]

para: 38 % ortho: 7 % OAc

OAc OAc

OAc

Abb. 84: Darstellung von bis-[p-AB]-ManMP 34 und bis-[o-AB]-ManMP 35

Die in Tabelle 6 aufgelisteten Ausbeuten der cycloSaligenyl-hexosemonophosphate sind vergleichbar mit denen der cycloSaligenyl-Nucleotide, wobei die Ausbeuten weitestgehend die Hydrolysestabiltät der Verbindungen wiederspiegeln (Kap. 4.3.1.1, S. 87).

Tabelle 6: Synthetisierte cycloSaligenyl-Hexosemonophosphate

Bezeichnung Ausbeute

32aI: Hexose = Man-1-P; X = H; R = Ac 59 %

32bI: Hexose = Man-1-P; X = 3-Me; R = Ac 62 %

32cI: Hexose = Man-1-P; X = 5-Cl; R = Ac 6 %

32eI: Hexose = Man-1-P; X = 3,5-Di-tBu; R = Ac 61 %

32dII: Hexose = Man-1-P; X = 5-tBu; R = Bz 70 %

32dIII: Hexose = Man-1-P; X = 5-tBu; R = Lev 27 %

33aI: Hexose = Gluc-1-P; X = H; R = Ac 23 %

33bI: Hexose = Gluc-1-P; X = 3-Me; R = Ac 38 %

33dII: Hexose = Gluc-1-P; X = 5-tBu; R = Bz 68 %

34: bis-[p-AB]-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-mannopyranosyl)-1-phosphat 38 % 35: bis-[o-AB]-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl)-1-phosphat 7 %

36a: Hexose = Man-6-P; X = H; R = Ac 64 %

36b: Hexose = Man-6-P; X = 3-Me; R = Ac 67 %

36c: Hexose = Man-6-P; X = 5-Cl; R = Ac 7 %

Im Gegensatz zu den cycloSaligenyl-Nucleotid erhebt sich bei den cycloSaligenyl-Hexose-1-monophosphaten die Frage nach der Konfiguration des anomeren Zentrums. Im allgemeinen läßt sich mittels eines ¹H-Spektrums die Konfiguration des anomeren Zentrums der glycosidischen Bindung klären. Gemäß der Karplus-Beziehung zeigen α-Glycoside mit einem Diederwinkel von 60 °, also einer cis-trans-Stellung von H-1 und H-2, Kopplungskonstanten von J1,2 ≈ 3.5 Hz. β-Glycoside mit einem Diederwinkel von 180 °, welches einer trans-trans-Stellung von H-1 und H-2 entspricht, weisen eine Kopplungskonstante von J1,2 ≈ 8.0 Hz auf.

Die drei gluco-Verbindungen 33aI, 33bI und 33dII zeigen Kopplungskonstanten von J1,2 ≈ 3.3-3.5 Hz und liegen folglich ausschließlich als α-Anomere vor.

Weit komplizierter sind die Verhältnisse bei den manno-Verbindungen, da beide Anomere ungefähr einen Diederwinkel von 60 ° aufweisen und somit sich auch die Kopplungskonstanten stark ähneln. Die Zuordnung von α- bzw. β-Mannopyranosiden erfolgt

durch ein ¹³C-gated-NMR-Spektrum. In diesem nicht entkoppelten Spektrum kann die Kopplungskonstante zwischen C-1 und H-1 bestimmt werden, deren Größe für beide Anomere signifikante Unterschiede aufweisen. α-Mannopyranoside besitzen Werte von ¹J C-1,H-1 ≈ 170-180 Hz, β-Mannopyranoside von ¹JC-1,H-1 ≈ 150-160 Hz.^151,152 Die untersuchten manno-Verbindungen des cycloSal-Phosphattriester sind α-anomerenrein.

Als Ergebnis bleibt festzuhalten, dass die etablierte Methode zur Darstellung von cycloSaligenyl-Nucleotiden¹²⁹ sich ebenfalls hervorragend zur Synthese von cycloSaligenyl-Hexosemonophosphaten eignet.

Bemerkenswert ist, dass die durch Etherschutzgruppen blockierten Mannopyranosen nicht phosphoryliert werden konnten. Ähnliches berichten auch PANNECOUCKE et al.¹⁴⁹ Um zu überprüfen, ob ein weiterer synthetischer Aufwand gerechtfertigt ist, sollten die pMb- und THP-geschützten 1-Allylmannopyranoside 90 und 92 entschützt werden. Neben der Milde der Reaktionsbedingungen ist vor allem die Dauer der Entschützung ausschlaggebend. Die Halbwertszeit der chemisch-gesteuerten cycloSal-Verbindungen liegt meistens im Bereich weniger Stunden, so dass eine längere Entschützungsdauer unweigerlich neben der Freisetzung der Hydroxyfunktionen am Monosaccharid zur Demaskierung der Phosphat-Einheit führt. Die Entschützung von 1-O-Allyl-2,3,4,6-tetra-O-p-methoxybenzyl-D -mannopyranosid 90 mit Cer(IV)ammoniumnitrat (CAN) in einem Acetonitril/Wasser-Gemisch (Abb. 85)¹⁵³ führte nach über 50 h nicht zur Deblockierung, so dass die Synthese des Phosphat-Triesters nicht weiter verfolgt wurde.

O O O

O O pMbpMb

pMb pMb

O 90

O HO O

HO HO O

H

89 CAN, ACN / H₂O

50 h, Rt

Abb. 85: Entschützung von 1-O-Allyl-2,3,4,6-tetra-O-p-Methoxybenzyl-α-D-mannopyranosid 90 mit CAN

Die Entschützung von 1-O-Allyl-2,3,4,6-tetra-O-tetrahydropyranyl-D-mannopyranosid 92 mit saurem Ionenaustauscher DOWEX 50W8 in Methanol¹⁵⁴ führte nach einer Stunde zu keinem Ergebnis. Durch die Zugabe von p-Toluolsulfonsäure¹⁵⁵ wurde dünnschicht-chromatographisch ein geringfügig tieferlaufender Spot beobachtet; vermutlich wurde die 6-Position entschützt. Erst die Zugabe von 5 %-iger Trifluoressigsäure in

Dichlormethan-Methanol führte nach 2.5 h zur Entschützung. Aufgrund der schwierigen Analytik und der Dauer der Entschützung wurden keine weiteren Arbeiten auf diesem Gebiet angestrengt.

Die Auswahl dieser sehr mild abspaltbaren Gruppen hatte zur Zielsetzung, nach Einbringung der maskierten Phosphat-Einheit zu entschützen, um so cycloSaligenyl-D -mannopyranosyl-1-phosphat 32aVI mit freien Hydroxyfunktionen an C-2, -3, -4 und C-6 zu erhalten. Um dieses Ziel dennoch zu erreichen, sollte cycloSaligenyl-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D -manno-pyranosyl)-1-phosphat 32aI enzymatisch deacetyliert werden.

Die Kohlenhydratchemie hat wahrscheinlich die längste Geschichte in der Anwendung von Enzymen.156,157,158 Vor allem auf dem Gebiet der selektiven Acetylierung bzw. Deacetylierung sind beachtliche Fortschritte erzielt worden.^159,160 Die Deacetylierung wurde mit Lipase aus Weizenkeimen (E.C. 3.1.1.3) unter sehr milden Bedingungen durchgeführt.161,162,163 Daneben wurden Cellulasen (E.C.3.2.1.4) aus Aspergillus niger und aus Trichoderma resei ausgewählt (Abb. 86), wobei in Vorversuchen (pH 7.0, 38 °C) mit Mannosepentaacetat lediglich die Cellulase aus Aspergillus niger zur vollständigen Deacetylierung führte.

AcO O AcO

O

O AcO

P O O O

32aI

Ac HO O

HO O

O HO

P O O O

32aVI H

E.C. 3.1.1.3 oder E.C. 3.2.1.4 37 °C, pH 6.8-7.3, PBS

Abb. 86: Deacetylierung von 32aI mit Lipase aus Weizenkeimen (E.C. 3.1.1.3) und Cellulasen (E.C.3.2.1.4) aus Aspergillus niger und aus Trichoderma resei

Die enzymatische Deacetylierung von cycloSal-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D -manno-pyranosyl)-1-phosphat 32aI wurde in einem Phosphatpuffersystem bei pH 6.5, 7.0, 7.3 und in dest. Wasser mit Aceton als Lösungsvermittler bei 37 °C im Thermoschüttler durchgeführt (Kap. 8.7.1, S. 131).¹⁶⁴ Die dünnschichtchromatographische Verfolgung der Reaktion zeigte unabhängig von der Dauer immer dasselbe Ergebnis. Der Eduktspot verschwand zu Gunsten eines sich auf der Startlinie befindlichen Spots und eines zweiten Spots der anhand der Referenzsubstanz 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-D-mannopyranose 78 zugeordnet wurde.

Die erfolglose enzymatische Deacetylierung ist unerheblich, da zeitgleich durchgeführte Forschungen davon ausgehen, dass die Acetylgruppen der Zuckereinheit für den passiven Membrantransport relevant sind.^165,166

Indessen wurden erste Kenntnisse über das hydrolytische Verhalten der neuartigen cycloSal-HMPs gesammelt, welches im folgenden Kapitel eingehend untersucht werden soll.

4.3 Resultate und Diskussion

Im Dokument Synthese, Untersuchung und mechanistische Interpretation von Prodrug-Konzepten an Nucleotidanaloga und Glycosylmonophosphaten (Seite 96-101)