4 Ergebnisse
4.4 Die Suche nach Substraten von LmxMPK1
4.4.2 Substratsuche mithilfe eines Peptid-Mikrochips
Eine weitere Methode, die zur Substratsuche von LmxMPK1 angewandt wurde war der Einsatz eines Peptid-Mikrochips (Pepscan, Lelystad; Niederlande). Dieser trägt Peptide, die Phosphorylierungsstellen bekannter Kinase-Substrate darstellen. Führt man nun auf dem Chip einen Aktivitätstest mit rekombinanter Kinase und radioaktiv markiertem ATP und eine anschließende Autoradiographie durch, so wird die Kinase bestimmte Peptide präferentiell phosphorylieren, die dann als Punkte auf dem Autoradiogramm erscheinen. Aus den Sequenzen der zugehörigen Peptide lässt sich dann ein Konsensus erstellen, mit dem eine Datenbanksuche nach passenden Substratproteinen durchgeführt werden kann.
Dieser Versuch wurde, vor allem zur Etablierung der Reaktionsbedingungen, zweimal mit einem sogenannten „Trial Chip“, der insgesamt 192 Peptide im Duplikat enthält, durchgeführt. Anschließend wurde die Kinase-Reaktion auf den sogenannten „Full slide“
angewendet (Abb. 29).
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Abb. 29: Autoradiogramm des „Full slide“-Peptidchips, 48 h Exposition. Die 24 Felder auf der linken Seite sind ein Duplikat der 24 Felder auf der rechten Seite.
Die Auswertung der phosphorylierten Peptide erfolgte in Ermangelung einer entsprechenden Software durch Jos Joore von der Firma Pepscan. Anhand der am stärksten phosphorylierten Peptide wurde der in Abb. 30 dargestellte Konsensus erstellt, mit dem anschließend eine Datenbanksuche unter http://www.genedb.org/genedb/leish/blast.jsp durchgeführt wurde. Ein konserviertes, hypothetisches Protein, welches die höchste Übereinstimmung mit dem Konsensus aufwies, LmjF32.3350, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Im folgenden wird dieses Gen als LmxUP für „unknown protein“ bezeichnet.
K K R A I S P R A A R K T V A K
R
Abb. 30: Mögliche Konsensussequenzen für Phosphorylierungsstellen putativer Substrate von LmxMPK1.
4.4.2.1 Eigenschaften von LmxUP und Homologien zu anderen Proteinen
Bei LmxUP handelt es sich um ein 3951 bp langes Gen, welches für ein unbekanntes, 1317 As umspannendes Protein mit einem Molekulargewicht von 142,3 kD codiert. Das Homologe Protein aus L. major stimmt ebenso wie ein Homologes aus L. infantum in seiner Aminosäuresequenz zu 83 % mit LmxUP überein. Eine Suche in den T. brucei- und T. cruzi-Datenbanken ergibt keine signifikante Sequenzhomologie über die gesamte Sequenz, allerdings existieren in T. cruzi zwei sogenannte Orthologe, die Proteine Tc00.1047053503839.19 und Tc00.1047053507089.220, die über bestimmte Sequenzbereiche Gemeinsamkeiten mit LmxUP aufweisen, aber ein viel geringeres Molekulargewicht (91,1 kD statt 142,3 kD) besitzen. Ein Vergleich der Sequenzen zeigt an, dass hier –wie auch bei LmxPK7- möglicherweise Insertionen stattgefunden haben.
Eine Datenbanksuche mit der Proteinsequenz in der NCBI-Datenbank ergibt keine weiteren homologen Proteine in anderen Organismen. Als nächste Verwandte werden hier das Homolog aus L. major sowie die beiden Orthologen aus T. cruzi angegeben. Einzige Gemeinsamkeit zu Proteinen aus anderen Organismen ist das einzige strukturelle Merkmal von LmxUP: Wie auch die beiden Orthologen aus T. cruzi weist es eine sogenannte „B-Box-Zinkfingerdomäne“ auf (As 761-803), die z. B. auch in Transkriptionsfaktoren oder DNA-modifizierenden Proteinen vorkommt und über die die Proteine mit Nukleinsäuren interagieren können. Eine Untersuchung der Aminosäuresequenz von LmxUP ergibt mit einer Wahrscheinlichkeit von 62,5 % eine nukleäre Lokalisation. Dies ergänzt die Vermutung, dass es sich um ein DNA-Interaktionsprotein handeln könnte. Ohne weitere Untersuchungen lässt sich aber keine Aussage über die Funktion von LmxUP treffen.
4.4.2.2 Isolierung des LmxUP-Gens aus einer L. mexicana- gDNA-Phagenbank und weitere Klonierungsschritte
Unter Verwendung der Oligonukleotide UP1.for und UP1.rev, die eine in Trypanosomatiden konservierte Region von LmxUP umspannen, wurde mittels PCR eine Digoxigenin-markierte Sonde hergestellt. Mit dieser wurde dann eine L. mexicana gDNA-Phagenbank durchsucht.
Es konnten positive Phagenklone isoliert und die DNA aufgereinigt werden. Nach präparativen Spaltungen mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI, NotI und XbaI und Ligation in den pBlueskript II (-)-Vektor konnte ein positiver Klon erhalten und sequenziert werden. Er enthält ein Insert, welches größer als 10 kb ist, auf dem der komplette ORF von LmxUP vorhanden ist. Das Plasmid trägt die Bezeichnung pBSKUP1.3.
Um das Gen für weitere Klonierungssschritte zugänglich zu machen, wurde auf dem o. g.
Plasmid eine PCR-Reaktion mit den Oligonukleotiden UP1BamHI/NcoI.for und UP1HindIII.rev durchgeführt und das Produkt in pCR2.1TOPO ligiert. Es wurde erneut sequenziert, um auszuschließen, dass bei der PCR Fehler eingebaut wurden. Anschließend wurde aus dem Vektor pCR2.1TOPOUP ein 3935 bp großes Fragment mithilfe der Restriktionsendonukleasen NcoI und HindIII ausgeschnitten und in pGEX-KG, der mit den gleichen Enzymen behandelt worden war, ligiert. Das resultierende Plasmid trägt die Bezeichnung pGEX-KGUPKl.5.
4.4.2.3 Expression in E. coli und Aufreinigung von GST-UP
Um in einem Kinase-Test zu überprüfen, ob es sich bei LmxUP tatsächlich um ein Substrat von LmxMPK1 handelt, wurde versucht, das Protein rekombinant in E. coli zu exprimieren und aufzureinigen. Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pGEX-KGUPKl.5 in E. coli BL21 transformiert und wie oben eine Testexpression durchgeführt, um die optimalen Induktionsbedingungen zu ermitteln. Bei Induktion mit 250 µM IPTG und Expression bei 18°C üN konnte eine Bande in der richtigen Größe festgestellt werden, woraufhin eine
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Expression und Aufreinigung von GST-LmxUP aus 500 ml E. coli-Kultur erfolgte. Im Eluat konnte eine Bande identifiziert werden, deren Größe in etwa der von rekombinantem GST-UP entspricht (168,3 kD). Leider konnte nur sehr wenig Protein erhalten werden, zudem waren im Eluat zahlreiche andere Banden in größeren Mengen zu erkennen, bei denen es sich evtl. um Abbauprodukte oder die Produkte eines frühzeitigen Kettenabbruchs bei der Proteinsynthese handeln könnte (Abb. 31).
Abbauprodukte GST-LmxUP
Abb. 31: Aufreinigung von GST-LmxUP aus 500 ml E. coli-Kultur. Dargestellt ist das 1. Eluat auf einem Coomassie-gefärbten 12%-igen SDS-PA-Gel.
4.4.2.4 Phosphorylierungstest von LmxMPK1 mit GST-LmxUP
Um zu überprüfen, ob es sich bei LmxUP tatsächlich um ein Substrat von LmxMPK1 handelt, wurde ein Phosphorylierungstest mit 2 µg LmxMPK1, der maximalen Menge (25 µl auf 50 µl Reaktionsvolumen; eine aussagekräftige Proteinmengenbestimmung war aufgrund der vielen kontaminierenden/ Abbau-Banden nicht möglich) rekombinantem GST-UP und radioaktiv markiertem ATP durchgeführt.
In Abb. 32 erkennt man ein ähnliches Ergebnis wie auch schon bei LmxTFIID. GST-LmxUP allein zeigt hier kaum Phosphorylierungsaktivität, nur eine sehr schwache Bande ist zu erkennen, die allerdings nicht auf der Höhe von GST-LmxUP läuft. In Spur 2 (LmxMPK1Wt) sieht man neben der Autophosphorylierung von LmxMPK1Wt auch wieder zwei kontaminierende Banden mit einem Molekulargewicht von ca. 62 kD, die leicht phosphoryliert werden (grüner Pfeil; siehe auch Abb. 10). Befinden sich die Kinase und GST-LmxUP im Ansatz (Spur 1), sieht man eine deutliche Verstärkung der Bande aus Spur 3, sowie einige andere phosphorylierte Banden, bei denen es sich wahrscheinlich ebenfalls um Abbauprodukte von GST-LmxUP handelt. Allerdings ist diese Phosphorylierung nicht besonders stark, z. B. im Vergleich mit dem künstlichen Substrat MBP und wird außerdem von der kontaminierenden Bande aus Spur 2 überlagert.
Trotzdem sollte überprüft werden, ob es sich bei dem zugehörigen Protein um ein Kettenabbruchprodukt von GST-UP handelt. Dazu wurde eine massenspektrometrische Analyse der Bande durchgeführt, die allerdings ohne Ergebnis blieb.
Somit lässt sich auch hier nicht eindeutig sagen, ob es sich bei LmxUP um ein in vitro -Substrat von LmxMPK1 handelt.
Abbauprodukte GST-LmxUP
Abb. 32: Phosphorylierungstest mit LmxMPK1Wt und GST-LmxUP. 1: LmxMPK1Wt + GST-LmxUP;
2: LmxMPK1Wt (Pfeil = kontaminierende Proteine); 3: GST-LmxUP. Links: Coomassie-gefärbtes 8%-iges SDS-PA-Gel; rechts: Autoradiogramm, 30 h Exposition.