Aktivität und Phosphorylierungsstatus von LmxMPK1Wt

Wie unter 1.2.5 erwähnt, wurden die Mutanten im Aktivierungsmotiv bereits vor Beginn dieser Arbeit hergestellt und in Leishmanien-Expressionsvektoren kloniert. Mit diesen Konstrukten, sowie einem Wt-Konstrukt wurde eine Deletionsmutante von LmxMPK1 transfiziert und rekombinante Leishmanien („add-backs“) erhalten, die nur noch die jeweilige Mutante von LmxMPK1 oder aber den Wt episomal exprimierten. Eine Überprüfung der Proteinexpression in Promastigoten mittels Immunoblot zeigte, dass die Kinase- inaktive Mutante (K43M) weniger gut exprimiert wurde als ein Wt-addback, die EDE-Mutante war gar nicht nachweisbar (Melzer und Wiese, 2007). Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass diese Mutationen, vor allem die EDE-Mutation, eine instabilisierende Wirkung auf die Kinase haben und diese daher schneller abgebaut oder gar nicht erst richtig gefaltet wird.

Da bisher keine Rolle für LmxMPK1 in Promastigoten bekannt war, sollte zunächst untersucht werden, ob das Fehlen von LmxMPK1 evtl. doch Auswirkungen auf das promastigote Lebensstadium der Parasiten hat. Zu diesem Zweck wurden Wachstumskurven des Wt, der Deletionsmutante sowie der jeweiligen „add-back“-Mutanten im Aktivierungsmotiv erstellt. Dabei ließ sich feststellen, dass die LmxMPK1-Deletionsmutante eine deutlich verlangsamte Proliferation aufweist. Die Parasiten teilten sich im Schnitt bis zu fünfmal langsamer als Wt-Promastigote. Möglicherweise spielt LmxMPK1 also auch bei der Proliferation und/oder Teilung der Promastigoten eine Rolle, für die Proliferation des amastigoten Lebensstadiums ist die Kinase essentiell (Wiese, 1998). Für eine Aufgabe der Kinase in Promastigoten spricht ebenfalls die Tatsache, dass die Kinase in diesem Lebensstadium exprimiert wird und, wie gezeigt (4.2.4.1) sowohl in Pro- als auch in Amastigoten ausschließlich in phosphorylierter, d.h. vermutlich aktivierter Form vorliegt.

Von allen Mutanten im Aktivierungsmotiv ist nur die EDY-Mutante in der Lage, die Wt-Proliferationsrate in Promastigoten zu erreichen (siehe 4.2.4.3). Im Infektionsexperiment konnte die Mutante ebenfalls die Deletionsmutante komplementieren und die Infektiosität der

Parasiten wieder herstellen (Melzer und Wiese, 2007). Interessanterweise liegt die EDY-Kinase in Promastigoten ausschließlich unter den nicht-phosphorylierten Proteinen vor. Dies deutet darauf hin, dass die in vitro beobachtete Tyrosin-Autophosphorylierung in vivo keine Rolle spielt. Unterstützend kommt hinzu, dass auch die ADY-Mutante, die allerdings sowohl in Pro- als auch in Amastigoten die Deletionsmutante nicht komplementieren kann, ebenfalls ausschließlich unter den nicht-phosphorylierten Proteinen zu finden ist. Es muss allerdings in Betracht gezogen werden, dass in beiden Mutanten der Threonin-Rest mutiert ist. Vielleicht ist dessen Vorhandensein für eine Phosphorylierung an Tyrosin in vivo notwendig.

Da die EDY-Mutante biologische Aktivität aufweist, bedeutet das, dass der negativ geladene Glutamatrest in der Lage ist, für ein phosphoryliertes Threonin zu substituieren und die Kinase zu aktivieren, wenn auch nachweisbar nur in vivo, da die rekombinante EDY-Mutante in vitro keine MBP-Phosphorylierung zeigt. In anderen Studien war eine konstitutive Aktivierung einer MAP Kinase durch Ersatz eines oder beider Reste im Aktivierungsmotiv durch geladene Aminosäuren nicht möglich (Her et al., 1993; Robbins et al., 1993; Zhang et al., 1995). Hier konnte bei einigen Kinasen, wie z.B. der MAP Kinase Hog1 aus S.

cerevisiae, durch Ersatz bestimmter Reste außerhalb des Aktivierungsmotivs eine Verstärkung der Aktivität bzw. eine konstitutive Aktivierung erreicht werden (Bell et al., 2001;

Bell und Engelberg, 2003). Auch für ERK2 konnten sogenannte „gain of function“-Mutanten außerhalb des Aktivierungsmotivs identifiziert werden, die vor allem zu einer stärkeren Autophosphorylierung der Kinasen an Tyrosin und Threonin führen und die Kinase damit fast unabhängig von einer Aktivierung durch MKK1 machen (Emrick et al., 2001). In dieser Hinsicht unterscheidet sich LmxMPK1 also deutlich von MAP Kinasen höherer Eukaryoten.

Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die EDY-Mutante -und wahrscheinlich auch die Wt-Kinase- von keiner anderen Kinase in vivo an Tyrosin phosphoryliert wird. Im Gegensatz dazu wurde für ERK2 gezeigt, dass sowohl eine EEY- als auch eine TEE-Mutante in vivo phosphoryliert werden (Her et al., 1993). Darüber hinaus zeigten beide Mutanten in Immunopräzipitationsexperimenten mit anschließendem Kinasetest keine Substratphosphorylierung gegenüber MBP, wie auch die rekombinant exprimierten korrespondierenden Mutanten von LmxMPK1. Da die beiden ERK2-Mutanten allerdings nicht in einem ERK2-Deletionshintergrund exprimiert wurden, lässt sich keine Aussage über ihre biologische Aktivität treffen.

Da die ADF-Mutante, die ebenfalls in beiden Lebensstadien nicht in der Lage war, das Fehlen von LmxMPK1 zu kompensieren, auch ausschließlich unter den nicht-phosphorylierten Proteinen zu finden ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass LmxMPK1 in vivo an keinem anderen Rest phosphoryliert wird, als an dem Threonin des Aktivierungsmotivs.

Diskussion 124

Für eine andere MAP Kinase aus L. mexicana, LmxMPK3, ist bekannt, dass sie ebenfalls an keinem Rest außerhalb des Aktivierungsmotivs phosphoryliert wird (Erdmann et al., 2006), zusätzlich konnte auch bei dieser Kinase in der durch LmxMKK aktivierten Form eine Tyrosinphosphorylierung bisher nicht zuverlässig nachgewiesen werden (Wiese und Mitarbeiter, unveröffentlicht).

Für andere MAP Kinasen konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sie nicht außerhalb des Aktivierungsmotivs (Her et al., 1993; Payne et al., 1991), trotz allem aber auch an dem Tyrosinrest des Aktivierungsmotivs phosphoryliert werden.

Einen weiteren Hinweis, der die Hypothese stützt, dass eine Phosphorylierung an Threonin für eine Aktivität von LmxMPK1 ausreichend ist, findet man bei Betrachtung der Eigenschaften der TDF-Mutante. Diese Mutante ist trotz des kompletten Fehlens des Tyrosinrestes in der Lage, sowohl in Pro- als auch in Amastigoten zumindest zumTeil das Fehlen von LmxMPK1Wt zu kompensieren. In Promastigoten proliferiert diese Mutante zwar langsamer als der Wt und die EDY-Mutante, aber deutlich schneller als die anderen Mutanten. In Infektionsexperimenten kann diese Kinase die Infektiosität der Parasiten in demselben Maß wiederherstellen, wie die EDY-Mutante. In vitro zeigt die Mutante keine Substratphosphorylierung, was entweder daran liegen kann, dass MBP, wie schon erwähnt, ein schlechtes Substrat darstellt, aber auch daran, dass die Kinase in vitro nicht an Threonin phosphoryliert ist, da ein Aktivator fehlt. In Promastigoten liegt die Mutante zum Teil in phosphoryliertem Zustand vor, ist aber auch unter den nicht-phosphorylierten Proteinen zu finden. Möglicherweise ist hier die Threoninphosphorylierung durch den Aktivator nicht so effektiv wie beim Wt, da der mutierte Phenylalaninrest die Phosphatübertragung stört.

Im Gegensatz dazu ist die TDE-Mutante nicht befähigt, die Proliferationsrate sowie die Infektiosität der Leishmanien wiederherzustellen, obwohl sie, genau wie die TDF-Mutante, in Promastigoten auch bis zu einem gewissen Grad phosphoryliert und somit aktiviert wird. Hier gibt es zwei Möglichkeiten, dies zu erklären: entweder ist durch den geladenen Glutamat-Rest anstelle des –normalerweise scheinbar nicht-phosphorylierten- Tyrosins die Substratbindung oder die Phosphatübertragung auf das Substrat nicht möglich, oder eine Phosphorylierung an Tyrosin (die durch das Glutamat vorgetäuscht wird) inaktiviert die Kinase zielgerichtet. Da in der TDF-Mutante nur der ungeladene Phenylalaninrest vorliegt, wird ein nicht-phosphoryliertes Tyrosin vorgetäuscht und die Substratphosphorylierung in vivo ist möglich, wenn auch wahrscheinlich schlechter als bei LmxMPK1Wt.

Für die Hefe-MAP Kinase Hog1 konnte ebenfalls gezeigt werden, dass der Tyrosinrest des Aktivierungsmotivs nicht essentiell für die biologische Aktivität ist. In diesem Fall war eine

TXF-Mutante von Hog1 in der Lage eine Hog1-Deletionsmutante zu komplementieren, obwohl die immunpräzipitierte TXF-Mutante in vitro keine Aktivität zeigte (Bell und Engelberg, 2003). Trotz allem ist aber nicht klar, ob der Tyrosinrest in der Wt-Hog1 phosphoryliert wird oder nicht. Auch für die Säuger-MAP Kinase ERK8 wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung an Threonin eine größere Rolle bezüglich der enzymatischen Aktivität spielt. Hier zeigte eine rekombinante ERK8, die an Tyrosin dephosphoryliert wurde eine um 15-20% reduzierte Aktivität, während eine Dephosphorylierung an Threonin zu einer 95%-igen Reduktion der Aktivität führte (Klevernic et al., 2006). Bei dieser Kinase sowie auch bei der Säuger-MAP Kinase ERK7, handelt es sich um MAP-Kinase-Homologe, die sich durch Autophosphorylierung an Threonin und Tyrosin selbst aktivieren können (Abe et al., 2001;

Klevernic et al., 2006; Abe et al., 2002). Dies kann für LmxMPK1 mit großer Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden, da sie sich nicht an Threonin autophosphoryliert (siehe 4.2.3.3).

Es konnte gezeigt werden, dass im Fall von LmxMPK1 in vivo eine Phosphorylierung an Tyrosin nicht stattfindet und für eine Aktivität der Kinase offensichtlich auch nicht nötig ist, was einen deutlichen Unterschied zu den MAP Kinasen höherer Eukaryoten darstellt.

Die oben diskutierte Hypothese einer Inaktivierung der Kinase durch Phosphorylierung an Tyrosin wäre allerdings ein völlig neuer, auf keine andere bekannte MAP Kinase zutreffender Mechanismus, daher ist diese Theorie bis zu ihrem Beweis reine Spekulation.

Normalerweise müssen MAP Kinasen sowohl an Threonin als auch an Tyrosin phosphoryliert sein, um maximale Aktivität zu erreichen (Cobb und Goldsmith, 1995). Könnte man diese Hypothese allerdings bestätigen, böte sich hier durch den gravierenden Unterschied zu MAP Kinasen höherer Eukaryoten ein höchst interessanter Ansatzpunkt für eine medikamentöse Therapie der Leishmaniasis.