Strategien zur Klonierung rekombinanter Plasmide für die Expression

Im Folgenden werden die Klonierungsstrategien zur Herstellung der rekombinanten Plasmide für die Expression der einzelnen Zielproteine beschrieben.

2.13.1 Klonierung von PpAOC1 und PpAOC2 in den pGEX-6-P-1 Vektor

Die Gene von PpAOC1 und PpAOC2 waren im Rahmen der Dissertation von M. Stumpe in den pGEM®-T Vektor (Promega, Mannheim, DE) kloniert worden. Da für die Kristallisation

37 von Proteinen hohe Proteinausbeuten kombiniert mit einer einfachen Reinigungsmethode vorteilhaft sind, wurden beide Gene in den pGEX-6-P-1 Vektor kloniert. Dieser enthält zusätzlich das Gen für eine Glutathion-S-Transferase, welche mit dem N-Terminus des Zielproteins fusioniert ist. Dazwischen ist eine PreScission Protease Schnittstelle eingefügt, über die Glutathion-S-Transferase und Zielprotein wieder getrennt werden können. Beide Gene konnten über jeweils über eine 5´BamHI und 3´HindIII Schnittstelle aus dem pGEM®-T Vektor geschnitten werden (2.12.7). Zunächst wurden beide pGEM®-pGEM®-T Konstrukte mit HindIII verdaut und anschließend eine Auffüllreaktion mit CIAP Enzym durchgeführt.

Dadurch wurde die HindIII Schnittstelle vom 5´zum 3´-Ende mit Nukleotiden aufgefüllt und es entstand eine glatte Schnittstelle. Dann wurde die Plasmid-DNA mit BamHI geschnitten.

Da die multiple cloning site des pGEX Vektors keine HindIII Schnittstelle enthält, wurde dieser mit BamHI und SmaI verdaut. Anschließend konnten die Fragmente mit dem Vektor ligiert werden (2.12.9), danach wurden XL1 Blue Zellen mit den Konstrukten transformiert und der Ligationserfolg durch eine Kolonie-PCR (2.12.3) mit vektorspezifischen Primern überprüft. Klone, welche ein Fragment in der erwarteten Größe besaßen, wurden für eine Plasmidpräparation (2.12.1) vervielfältigt, anschließend sequenziert (2.12.6) und in die Expressionszelllinie E. coli BL21star transformiert (2.12.11).

2.13.2 Zielgerichtete Mutagenese von PpAOC1 und PpAOC2

Für die zielgerichtete Mutagenese von PpAOC1 und PpAOC2 wurden folgende Primer verwendet (Tabelle 2.1).

Tabelle 2.1: Primer für die PpAOC-Mutagenese.

Primerbezeichnung Nukleotidsequenz

5´AOC1 E18Q CAT GTG CAG GAG CTG TTT GTA TAC CAA ATC AAT GAG CGC GAC CG 3´AOC1 E18Q CG GTC GCG CTC ATT GAT TTG GTA TAC AAA CAG CTC CTG GAC ATG 5´AOC1 E18D CAG GAG GTG TTT GTG TAC GAT ATC AAT GAC CGC GAC CG

3´AOC1 E18D CG GTC GCG CTC ATT GAT ATC GTA CAC AAA CAC CTC CTG

5´AOC1 F29I C AAT GAG CGC GAC CGT GGA TCC CCT GTG ATC TTG CCC TTC GGA AAG

3´AOC1 F29I CTT TCC GAA GGG CAA TAT CAC AGG GGA TCC ACG GTC GCG CTC ATT G

5´AOC2 E18Q GTA CAG GAG CTC TCA GTA TAC CAG ATT AAT GAG CGA GAT AG 3´AOC2 E18Q CT ATC TCG CTC ATT TTA TTG GTA TAC TGA GAG CTC CTG TAC 5´AOC2 E18D CAG GAG CTC TCA GTA TAT GAT ATC AAT GAG CGA GAT AGA GG 3´AOC2 E18D CC TCT ATC TCG CTC ATT GAT ATC ATA TAC TGA GAG CTC CTG

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5´AOC2 I29F C AAT GAG CGA GAT AGA GGA TCC CCT GTG TTC TTG CCA TTC GGT GGC AAG

3´AOC2 I29F CTT GCC ACC GAA TGG CAA GAA CAC AGG GGA TCC TCT ATC TCG CTC ATT G

5´AOC2 N44F GGC AAG AAG GAC GAA AAT GGC GCC CAT GCC TTC AGT CTC GGC GAC CTT GTG

3´AOC2 N44F CAC AAG GTC GCC GAG ACT GAA GGC ATG GGC GCC ATT TTC GTC CTT CTT GCC

Die PCR wurde, wie in Abschnitt 2.12.4 beschrieben, durchgeführt. Dabei wurde eine Elongationszeit von 11 min gewählt. Anschließend wurden die Ansätze mit DpnI verdaut und für Plasmidpräperation in E. coli XL1 Blue Zellen transformiert. Die Plasmid-DNA wurde parallel zur Wildtyp-DNA mit dem jeweiligen Enzym verdaut, dessen Restriktionsschnittstelle mit der Mutagenese eingeführt worden war. Nach erfolgter Agarosegelelektrophorese wurden die Klone mit einer zusätzlichen Schnittstelle sequenziert und die Expressionszelllinie E. coli BL21star mit den Konstrukten transformiert (2.12.11).

2.13.3 Klonierung von PpLOX1 in verschiedene Vektoren des pET-Systems

Für die Klonierung von PpLOX1 in verschiedene Vektoren des pet-Systems (pET24b, pET28a) wurden die in Tabelle 2.2 aufgeführten Primer verwendet. Als Ausgangsplasmid wurde ein Volllängenklon im pQE30-Vektor von T. Senger verwendet.

Tabelle 2.2: Primer für die PpLOX1-Klonierung.

Primerbezeichnung Nukleotidsequenz

5´PpLOX1 NheIa 5´AAA GCT AGC ATG CTC AAC CGG TTG GAG ACG GGG AGC

PpLOX1-NheIa-10His

5´ACG GCT AGC CAC CAT CAC CAT CAC CAT CAC CAT CAC CAT CTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCC ATG ATG CTC AAC CGG TTG GAG ACG

PpLOX1-HindIIIb 3´ATC AAC AGG AGT CCA AGC TCA GCT AAT TAA GCT TCT ATA GCT TCT ATA TGG TGA TGC TGT TGG GC

Die PCR wurde, wie in Abschnitt 2.12.2 beschrieben, durchgeführt. Dabei wurde das folgende Programm gewählt.

1. 98 °C 30 s 2. 98 °C 20 s 3. 72 °C 2,15 min

39 Der Zyklus von 2. - 3. wurde 10-mal wiederholt.

4. 98 °C 20 s 5. 70 °C 30 s 6. 72 °C 1,30 min

Der Zyklus von 4. - 6. wurde 15-mal wiederholt.

7. 72 °C 10 min

Die PCR-Produkte mit der erwarteten Größe von 2822 kb wurden direkt in den pJET blunt end 1.2 Vektor ligiert. Von positiven Klonen wurde die Plasmid DNA präpariert und das PpLOX1 Fragment durch Enzymverdau (NheI, HindIII) isoliert. Parallel dazu wurde die Vektor-DNA mit den entsprechenden Enzymen geschnitten. Das PpLOX1 Fragment wurde anschließend in den Vektor ligiert. Die Ligationsansätze wurden vollständig in XL1 Blue Zellen transformiert und der Ligationserfolg durch eine Kolonie-PCR (2.12.3) mit genspezifischen Primern überprüft. Klone, welche ein Fragment in der erwarteten Größe besaßen, wurden für eine Plasmidpräparation (2.12.1) vervielfältigt, anschließend sequenziert (2.12.6) und die Expressionszelllinie E. coli BL21star mit den Konstrukten transformiert (2.12.11).

2.13.4 Herstellung von PpLOX1 ohne Signalpeptid (∆PpLOX1)

Für die Herstellung von PpLOX1 ohne CTS (∆PpLOX1) und anschließender Klonierung in den pET24a Vektor wurde der in Tabelle 2.3 aufgeführte 5´Primer verwendet.

Tabelle 2.3: Primer für die Klonierung von PpLOX1 ohne Signalpeptid.

Primerbezeichnung Nukleotidsequenz

PPLOXshort_fw AAA AGA TCT ATG AAG AAG CTG AAG GTG CT GGA C

Die gesamte Klonierung wurde wie in Abschnitt 2.13.3 beschrieben durchgeführt. Das PpLOX1 Fragment ohne CTS besitzt eine Größe von 2200 kb.

2.13.5 Zielgerichtete Mutagenese von PpLOX1

Für die zielgerichtete Mutagenese von PpLOX1 wurden die in Tabelle 2.4 aufgeführten Primer verwendet.

Tabelle 2.4: Primer für die PpLOX1 Mutagenese.

Primerbezeichnung Nukleotidsequenz ppLOX_5´_Y851F

CAC CAC AAC TGC GAT GTC TGT CTT CGA AGT GCT GTC GGC GCA CTG TC

40 Elongationszeit von 16 min gewählt. Anschließend wurden die Ansätze mit DpnI verdaut und für Plasmidpräperation in E. coli XL1 Blue Zellen transformiert. Die Plasmid-DNA der Klone wurde parallel zur Wildform-DNA mit dem jeweiligen Enzym verdaut, dessen Restriktionsschnittstelle eingeführt worden war (2.12.7). Nach erfolgter Agarosegelelektrophorese wurden die Klone mit einer zusätzlichen Schnittstelle sequenziert und die Expressionszelllinie E. coli SG13009 mit den Konstrukten transformiert (2.12.6 und 2.12.11).