FCS-Modul
3.4 Statistische Verteilung von Fluorophoren
Vor jeder Bindungsstudie mit FCS wird ein zu untersuchendes Substrat fluoreszenzmarkiert. Häu-fig jedoch ist die Anzahl der Fluorophore am Reaktionsprodukt nicht bekannt. An Proteinen, die mit chemisch reaktiven Derivaten kleiner, organischer Fluoreszenzfarbstoffe markiert werden, sind normalerweise mehrere funktionelle Gruppen reaktiv. Auch mag die Anzahl der möglichen Bin-dungsstellen durch posttranslationale Modifikationen eines isolierten Proteins variieren. Zudem ist eine Sättigung der Bindungsstellen oft präparativ nicht möglich, da dann auch unspezifische Bindung an weitere funktionelle Gruppen erfolgt oder die biologische Funktionalität des Proteins zerstört wird. Markiert man ein Protein mit mehreren Bindungsstellen gleicher Affinität, so erhält man gleichartig diffundierende Teilchen, an denen ganzzahlige Vielfache von Fluorophoren stati-stisch gebunden sind. Abb. 3.8 illustriert, daß der gleiche Formalismus auch auf Fälle anwendbar ist, bei denen homogen markierte Monomere oligomerisieren: Interferieren die Fluorophore nicht mit der Bindung, dann erzeugt vollständige Bindung von markierten und unmarkierten Monome-ren eine Binomialverteilung der Fluorophore in den Komplexen. Schließlich führt die Applikation von zwei verschiedenfarbigen Fluorophoren (Monomere) am Substrat zu einer Trinomialvertei-lung spektraler Klassen von Markierungsprodukten (Oligomere).
Der Einfluß statistisch verteilter Farbstoffe auf die Korrelationsfunktionen wurde in (Tewes, 1998) abgeleitet. Für ein Ensemble von Molekülen (Komplexe) mit n potentiellen Bindungsstel-len (Grad der Multimerisierung), ist die Wahrscheinlichkeit, Fluorophore des Typs g (grün) und Fluorophore des Typs r (rot) zu finden, mit
(16)
gegeben. und bezeichnen die Wahrscheinlichkeiten, daß eine Bindungsstelle im Molekül (Komplex) den Fluorophor der entsprechenden Farbe trägt (für das Anfangsverhältnis der Mono-mere markiert in der entsprechenden Farbe) und für die Wahrscheinlichkeit, daß die Bindungsstelle leer (der Monomer unmarkiert) ist.
Jede Subspezies im Sinne von Gl. (10) bildet eine Klasse, die durch eine bestimmte Kombination von und definiert ist. Die Konzentrationen der einzelnen Subspezies werden durch die Wahrscheinlichkeit bestimmt, ein solches Molekül zu bilden, skaliert mit der Gesamtkonzentra-tion der Teilchen (Komplexe) in Lösung: . Die charakteristischen Konzentra-tionen sind einfache Vielfache der gebundenen Fluorophore des entsprechenden Typs . Benutzt man die statistischen Momente erster und zweiter Ordnung, (siehe Anhang), so läßt sich die Korrelationsfunktion ableiten
. (17)
Gl. (17) wird transparent für den Fall eines idealisierten Systems mit sauber getrennten Detektionskanälen; und werden null und man erhält für die Kreuzkorrelationsamplitude
. (18)
... ... ... ...
a b
Abbildung 3.8 Statistische Verteilung von Fluorophoren am Komplex in Anlehnung an (Tewes, 1998). (a) Mar-kierung eines Makromoleküls mit kleinen Farbstoffen an mehreren Bindungsstellen oder (b) Oligomerisierung von homogen markierten Monomeren zu Komplexen mit einer einheitlichen Stöchiometrie führt zu spektralen Klassen von Teilchen mit gleichen hydrodynamischen Eigenschaften.
pg pr
Die maximal erreichbare Amplitude des Ensembles ist reduziert, und es überrascht, daß dieses Verhalten nicht von den Markierungswahrscheinlichkeiten und abhängt. Zum besseren Verständnis betrachten wir eine einfache homonome Dimerisierung. Werden gleich viel rote und grüne Monomere in die Reaktion eingesetzt , wird die Hälfte der Dimere beide Farben tragen, ein Viertel zwei rote und das restliche Viertel zwei grüne Fluorophore. Insgesamt ist die Amplitude damit auf 1/2 reduziert. Wird eine Sorte von Teilchen dagegen im Überschuß einge-setzt, z.B. , so werden sich hauptsächlich grüne Dimere bilden. Gleichzeitig befinden sich aber mehr rote Teilchen in zweifarbigen Komplexen, was die Kreuzkorrelationsamplitude erhöht.
Die Rechnung zeigt, daß sich die beiden antagonistischen Effekte gerade kompensieren. Diese Argumentation setzt natürlich voraus, daß das Signal-zu-Rausch-Verhältnis bei beiden Kanälen ausreichend hoch ist. Mit zunehmender Anzahl an Bindungsstellen n geht die Korrelationsampli-tude schließlich in die eines einheitlich zweifarbigen Dimers über, da die Wahrscheinlichkeit, ein-fach markierte Komplexe zu finden, sich an Null annähert.
Im Gegensatz zur Kreuzkorrelation steigt die Autokorrelationsamplitude gegenüber einem homo-gen markierten Standard und hängt von , der Wahrscheinlichkeit einen Fluorophor des ent-sprechenden Typs am Molekül (Komplex) zu finden, ab:
. (19)
Für sehr kleine sind immer weniger Teilchen fluoreszenzierend, und die Amplitude folgt in reziproker Weise der Konzentration an Fluorophoren. Es ist bemerkenswert, daß bei diesem Aus-druck trotz einer Verteilung von Helligkeiten die Linearität zwischen Amplitude und Gesamtkon-zentration c der Teilchen erhalten bleibt.
3.5 Charakterisierung einer synthetischen Markierung mit Autokorrelation
Als eine Anwendung soll ein typisches Markierungsexperiment behandelt werden. Nehmen wir den bereits erwähnten Fall einer Bindung eines relativ kleinen organischen Farbstoffs an ein Pro-tein mit nur einer Bindungsstelle, aber einer Fluoreszenzlöschung im gebundenen Zustand . Wenn Reste ungebundenen Farbstoffs in der Lösung verbleiben, ist die mittlere Intensität der Lösung durch Beiträge beider Teilchensorten gegeben:
, (20)
wobei für die Gesamtkonzentration der Teilchen steht, die zunächst nicht bekannt ist. Die charakteristische Intensität des freien Farbstoffs kann separat bei gleichen Bedin-gungen (Anregungsintensität, Filtersatz, usw.) gemessen werden
, (21)
was gleichzeitig die Bestimmung des Fokusvolumens erlaubt, wenn die Konzentration oder der Diffusionskoeffizient der Farbstoffs bekannt ist. Durch Anpassung einer zweikomponentigen Modellfunktion können die relativen Anteile der Amplitude ermittelt werden. Ver-gleich der Koeffizienten auf beiden Seiten der Gl. (10) ergibt zwei zusätzliche Bedingungen
(22)
(23)
und das Gleichungssystem (21), (22) und (23) kann mit gelöst werden
(24)
. (25)
Das Produkt von Amplitude und mittlere Rate repräsentiert für den freien Farbstoff dessen mole-kulare Helligkeit. Ohne Fluoreszenzlöschung reduzieren sich Gl. (24) und (25) auf
und in Übereinstimmung mit der bereits dargestellten Theorie.
Ein numerisches Beispiel: Die gemessene Amplitude der Mischung sei gleich eins ( ), und die Kurvenanpassung einer zweikomponentigen Funktion ergebe 30% einer schnelldiffundie-renden Komponente . Nehmen wir weiter an, daß das Produkt aus Amplitude und mittlerer Rate gegenüber dem freien Farbstoffs auf R = 0.6 reduziert ist, dann ergibt Gl. (24) eine
c = c( )1 +c( )2
Fluoreszenzlöschung von etwa 50% . Einsetzen in Gl. (25) liefert die wahren relativen Anteile der Spezies von 10% freiem Farbstoff und 90% markiertem Protein. Fluo-reszenzlöschung um wirkt über Gl. (11) auf die Korrelationsamplitude zurück. Die Amplitude einer solchen Mischung ist gegenüber einer gleichen Konzentration einer der beiden Spezies um
12.4% erhöht ( ).