Mobilität und Helligkeit von H2B-EYFP im Cytoplasma

Die quantitative Interpretation von konfokalen Fluoreszenzbildern ist durch die Bestimmung der molekularen Helligkeit von H2B-EYFP bei einer festgelegten Beleuchtungsintensität möglich. Die Messung erfolgt im Cytoplasma, wo die fluoreszierenden Proteine synthetisiert werden und noch frei beweglich sind. Über die Fluktuationsamplitude der Korrelationsfunktion kann hier die mitt-lere Anzahl der Teilchen im Fokusvolumen bestimmt werden. Unabhängig davon liefert die Mes-sung auch deren mittlere Fluoreszenzintensität und damit eine direkte Relation zwischen diesen beiden Größen.

Abb. 5.11 a zeigt zwei kombinierte Durchlicht- und Fluoreszenzbilder einer Hela-Zelle. Es sind deutlich der cytoplasmatische Saum zu erkennen sowie der dunkle Zellkern. Im Cytoplasma wurde an drei Positionen jeweils für eine Minute FCS gemessen. Das rechte Bild belegt, daß die Zelle in ihrer Form aus der FCS-Messung unverändert hervorgeht. Mißt man mit zu hoher Inten-sität, so kugeln sich die Zellen ab. Die Autokorrelationskurven der entsprechenden Positionen wurden in Abb. 5.11 b ausgewertet. Gegenüber Abb. 5.6 d sind diese Kurven sehr verrauscht, was an der sehr kleinen Beleuchtungsintensität liegt, mit der hier gearbeitet wird; man mißt hier eine etwa 200 nM Lösung mit einer Fluoreszenzausbeute von nur 10 kHz. Aus der Fluktuationsampli-tude läßt sich bei Berücksichtigung eines autofluoreszierenden Untergrunds von etwa 1 kHz ein Konzentrationswert ermitteln. Die Werte sind positionsabhängig und erscheinenden im hyalinen Ectoplasma kleiner als im granulären Endoplasma. Die Variabilität der Konzentration beträgt in

dieser Zelle 34%, wohingegen die molekulare Helligkeit mit 0.29 ± 0.03 kHz/Teilchen vergleichs-weise konstant bleibt.

Insgesamt wurden 21 Zellen in mehreren Serien mit unterschiedlicher Anregungsintensität gemesssen. Obwohl die Laserintensität um einem Faktor 3 varriiert wurden, blieben die Konzen-trationswerte stabil. Bis zu 25 kHz konnten detektiert werden, ohne daß Bleicheffekte die Inten-sität über einen Lauf von 10 s meßbar absinken ließen. Dies ist eine wichtige Voraussetzung zur Auswertung der Amplituden, da bei Bleichen das absinkende Signal eines Laufs mit sich selbst korreliert und die Amplitude verschiebt. Mittelung der Konzentration freier Histonfusionspro-teine im Cytoplasma der Interphase von Klon H2B-Y ergab 206 ± 45 nM (15 Zellen). Zwei Zel-len wurden während der Metaphase gemessen, in der die Kernhülle aufgelöst ist und sich die kondensierten Chromosomen in der Äquatorialebene der Zelle anordnen. Hier betrug die Kon-zentration etwa 600 nM, also das Dreifache, und diese Erhöhung ist vermutlich eine Folge der Verschmelzung von Cyto- und Nukleoplasma. Die molekulare Helligkeit ist in der Meta- und Interphase gleich. Von den in der Interphase gemessenen Zellen ließ sich eine kleine Population (20%) abgrenzen, die im Cytoplasma eine auffallend niedrige Konzentration von nur 80 nM H2B-EYFP enthielten, aber deren molekulare Helligkeit gleichzeitig um etwa das Zweifache erhöht war. Die Intensität der Fluoreszenz war hier mit den anderen Zellen vergleichbar. Diese Ergebnis spricht für eine Multimerisierung der fluoreszierenden Histone in bestimmten Phasen des Zellzyklus.

Die Korrelationskurven in Abb. 5.11 zeigen, daß die Histone im Cytoplasma frei beweglich sind.

Die Kurven wurden mit einer Modellfunktion für zwei nicht-strahlende Zustände und ein bis zwei diffusiven Komponenten angepaßt. Da die Kurven sehr verrauscht waren, wurden die

Korre-0.01 1 100

FCS an H2B-EYFP im Cytoplasma.

(a) Negativ eines pseudokonfokalen Bildes (PD = 0.2 µm, z = 3 µm) links vor und rechts nach der FCS-Messung.

(b) Autokorrelationskurven der angezeigten Positionen (1, 2 und 3) geben die Konzentra-tion der Teilchen. Im granulären Plasmabe-reich erscheinen langzeitliche Korrelationen (Pfeil), die mit einer behinderten Diffusion erklärt werden können.

lationszeiten der nicht-strahlenden Zustände auf die in vitro ermittelten Werte fixiert (siehe Abb. 5.7). Die Diffusionszeit der schnellen Komponente bewegte sich bei etwa 1 ms und ergab einen über alle 21 Zellen gemittelten Diffusionskoeffizienten von 7 ± 4 µm²/s. Zum Vergleich:

unter der Annahme, daß die Viskosität im Cytoplasma um etwa einen Faktor 5 gegenüber Wasser erhöht ist (Wachsmuth et al., 2000), ergäbe sich für das Mononukleosom (MW ≈ 230000 kDa) ein Diffusionskoeffizient⁵ von etwa 5 µm²/s. Berücksichtigt man den Unterschied im Molekular-gewicht zu H2B-EYFP (MW ≈ 40 KDa) unter der vereinfachten Annahme einer globulären Struktur, so wäre für dieses Histonfusionsprotein D_t ≈ 9 µm²/s zu erwarten. Dieser Wert wird im Rahmen des Meßfehlers gut wiedergegeben. Die Abweichung in Richtung langsamerer Diffusion könnte ein Indiz dafür sein, daß die Histone im Cytoplasma nicht als einzelne Proteine, sondern im Komplex mit anderen Komponenten diffundieren.

Etwa 2/3 der Kurven enthielten eine zweite Komponente mit einer sehr langen Korrelationszeit von ~200 ms. Da die Amplituden und damit die Teilchenzahlen in den ein- und zweikomponen-tigen Korrelationskurven vergleichbar waren, kann es sich nicht um eine Aggregation handeln.

Dieses Verhalten wird hier mit behinderter Diffusion in Verbindung gebracht. Die Proteine bewegen sich in der Zelle in einem System von Membranen und molekularen Netzwerken, so daß ihre Bewegung räumlich eingeschränkt wird. Für die Berücksichtigung dieser Effekte wurde eine spezielle analytische Korrelationsfunktion abgeleitet, die solche langzeitlichen Korrelationen für eine räumlich eingeschränkte Diffusion voraussagt. Es wurde gezeigt, daß dieses Verhalten adäquat mit einer zusätzlichen „diffusiven“ Komponente in einer mehrkomponentigen Modell-funktion berücksichtigt werden kann (Qian et al., 1999). In Übereinstimmung mit der Vorstel-lung von Diffusionsbarrieren in der Zelle erwies sich die Behinderung als positionsabhängig. Die Messungen in Abb. 5.11 zeigen, daß diese langzeitlichen Korrelationen hier im granulären Endo-plasma (Positionen 2 und 3), nicht aber im hyalinen EctoEndo-plasma (Position 1) auftreten. In man-chen Experimenten wurde die Behinderung durch die Messung selbst induziert. Wurde z.B.

viermal in einer Zelle gemessen, so stellen sich langzeitliche Korrelationen häufig erst an der drit-ten oder vierdrit-ten Position ein. Die deponierte Energie oder das eingestrahlte Licht wird von der Zelle offensichtlich als Reiz perzipiert. Die Reizreaktion bewirkt eine Formveränderung der Zelle, wodurch der Zellkern häufig um mehrere µm angehoben wurde. Eine Verformung oder die Bewegung der Zellen wurde mit konfokaler Bildnahme vor und nach den Messungen stets kon-trolliert.

Die Reizwirkung der Lichteinstrahlung konnte durch sehr niedrige Anregungsintensitäten mini-miert werden. Diese Maßnahme ergab sich auch aus den Randbedingungen für die konfokale Bildnahme: Beim Scannen fluoreszierender Kerne war der dynamische Bereich für die Fluoreszen-zintensitäten durch 8 bit = 255 Werte begrenzt. Um Dichteunterschiede im Chromatin maximal aufzulösen, durfte die akkumulierte Intensität eines Bildpunkts nicht in die Sättigung geraten. Vor einem Experiment wurde die Anregungsintensität so justiert, daß H2B-EYFP im Cytoplasma mit

5. Der Diffusionskoeffizient von Mononukleosomen in einer wässrigen Umgebung wurde in Kap. 4.4.3 mit 24 µm²/s bestimmt, siehe auch Abb. 5.8

einer Fluoreszenzausbeute zwischen 0.2 und 0.4 kHz/Teilchen meßbar war. Die molekulare Hel-ligkeit wurde dann an mehreren Zellen im Cytoplasma bestimmt und der gemittelte Wert für die Auswertung der konfokalen Bilder und Bleichkurven herangezogen.

5.3.2 Eine mobile Fraktion von Histonen diffundiert relativ schnell im