1 EINLEITUNG
1.2.5 Spaltung des F-Proteins
Die proteolytische Spaltung der Vorläufer-Einheit F0 in die beiden Untereinheiten F1 und F2
ist für die Aktivierung des Virus absolut essentiell. Erst mit der Spaltung des Fusionsproteins ist das Virus in der Lage, mit der Wirtszellmembran zu fusionieren und so in die betroffene Zelle einzudringen. Die verantwortliche Protease, die diese Spaltung bewirkt, ist im Lungengewebe von Mäusen und Ratten, den natürlichen Wirten des Sendai-Virus, lokalisiert (TASHIRO et al., 1990, 1992). Namentlich ist dies die Tryptase Clara, die von bronchialen Epithelzellen in das Lungengewebe abgegeben wird und so die externe Spaltung des SeV-Fusionsproteins gewährleistet. Diese Protease ist vornehmlich im Lungengewebe vorhanden, wodurch sich der strenge Pneumotropismus des Sendai-Virus erklären lässt (TASHIRO &
HOMMA, 1983). Der Infektionsort ist also abhängig von der Anwesenheit aktiver, gewebsspezifischer Proteasen (MOCHIZUKI et al., 1988).
Es konnte allerdings noch eine andere Trypsin-ähnliche Protease identifiziert werden, die zur spezifischen Spaltung des SeV-F befähigt ist. Sie ähnelt dem Blutgerinnungsfaktor X und ist in der Allantoisflüssigkeit von embryonierten Hühnereiern zu finden (MURAMATSU &
HOMMA, 1980). In Zellkultur kann damit eine Aktivierung des Sendai-Virus herbeigeführt werden.
Das SeV-Fusionsprotein hat eine monobasische Spaltstelle mit der Folge –Q-S-R-F-F-. Die Spaltung erfolgt nach dem singulären Arginin (BLUMBERG et al., 1985). Man kann diese Spaltung in Zellkultur durch Zugabe einer exogenen Serin-Protease, wie z.B. Trypsin erreichen (SCHEID & CHOPPIN, 1974). Diese monobasische Spaltstelle ist unter den Paramyxoviren wie auch bei anderen Virusfamilien eher die Ausnahme, wie die Tabelle 4 zeigt (GARTEN et al., 1994). Eine Vielzahl viraler Oberflächenproteine weisen eine multibasische Spaltstelle der Abfolge –(R)-R-X-K/R-R- auf. Wie schon bei RSV ausgeführt, ist dies das Erkennungsmotiv für die ubiquitäre Subtilisin-ähnliche Protease Furin, welche im Golgi-Apparat der meisten Zelltypen zu finden ist (GARTEN et al., 1994; KLENK &
GARTEN, 1994; BOLT & PEDERSEN, 1998).
Tabelle 4: Spaltstellenmotive viraler Glykoproteine
Humanes Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) env VQREKR AV Herpesviridae
1:Wichtige basische Aminosäuren des Spaltstellenmotivs sind durch Fettdruck hervorgehoben.
1.2.6 Genomstruktur und Virusvermehrung
Die einzelsträngige, negativorientierte genomische RNA des Sendai-Virus beseht aus 15.384 Nukleotiden. Die Gene für die 6 Strukturproteine sind wie folgt in 5’-Richtung angeordnet:
3’-N-P/C-M-F-HN-L-5’.
Am aminoterminalen Ende des Genoms befindet sich eine leader-Sequenz, die zwar transkribiert wird, jedoch nicht für Aminosäuren kodiert. Am carboxyterminalen Ende liegt eine nicht transkribierte trailer-Sequenz.
Das P/C-Gen kodiert für das Phosphoprotein und sieben Nichtstrukturproteine (C, C’, Y1, Y2, X, V, W). Die Ursache für die Synthese unterschiedlicher Proteine liegt in der Verwendung verschiedener Startkodons und der dadurch entstehenden diversen Leserahmen innerhalb des P/C-Gens (CURRAN & KOLAKOFSKY, 1989, 1990). Das C-Protein wirkt als Interferon-Antagonist und beeinflusst so immunologische Vorgänge innerhalb der Wirtszelle (GARCIN et al., 1999). Außerdem hat das C-Protein die Fähigkeit, Apoptose auszulösen, also den programmierten Zelltod herbeizuführen (ITOH et al., 1998). Die Funktionen der Nichtstrukturproteine sind bisher weitgehend unbekannt, es handelt sich aber vermutlich um regulatorische Funktionen im Bereich der Expression (siehe Tabelle 3) (CHANOCK et al., 2001).
Über das Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein wird der Kontakt mit der Zielzelle hergestellt. Die Adsorption erfolgt an sialinsäurehaltige Rezeptoren auf der Zelloberfläche.
Daraufhin kann das Fusionsprotein, das zuvor durch eine extrazelluläre trypsinähnliche Protease gespalten sein muss, die Verschmelzung der Viruslipidhülle mit der Plasmamembran der zukünftigen Wirtszelle einleiten. Dies geschieht über den hydrophoben Abschnitt am N-terminalen Ende der F1-Untereinheit, der nach der Aktivierung des Fusionsproteins in einer exponierten Stellung ist (OHUCHI & HOMMA, 1976). Somit kann das Nukleokapsid in die Zelle eingeschleust werden (Penetration).
Die Synthese der viralen Komponenten erfolgt im Zytoplasma der infizierten Zelle. Zunächst wird ein primäres Transkript durch die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase synthetisiert.
Von einem Promotor am 5’-Ende werden alle 6 viralen Gene durch einen Polymerasekomplex aus L, N und P transkribiert, und es entstehen 8 polyadenylierte, mit einer 5’-Cap-Struktur versehenen mRNAs. Die intergenischen Sequenzen werden nicht transkribiert. Letztlich liegen die mRNAs der am 3’-Ende transkribierten Gene in größeren Mengen, vor als die mRNAs der Gene, die näher am 5’-Ende kodiert sind. Es entsteht ein Expressionsgradient, ein Regulationsmechanismus für die quantitative Bildung der viralen Proteine (GLAZIER et al., 1977; HOMANN et al., 1990).
Mit zunehmender Zahl der Virusproteine N und P kommt es zur Umschaltung von der Transkription zur Replikation der negativ orientierten RNA. Da bei der Genomreplikation alle Terminations-Signale überlesen werden (VIDAL & KOLAKOFSKY, 1989), wird eine nicht modifizierte, antigenomische RNA mit positiver Polarität gebildet, die von Nukleokapsid-Proteinen verpackt wird.
Die Bindung von Nukleokapsiden an virale Oberflächenproteine erfolgt vermutlich bereits an der intrazellulären Membran des Golgi-Apparates (SANDERSON et al., 1994). Dort interagieren die viralen Transmembranproteine HN und F0 über die zytoplasmatische Domäne mit dem Matrixprotein. Das M-Protein wiederum bindet die Nukleokapside über das N-Protein und wirkt so als Mediator zwischen den Glykoproteinen und dem Nukleokapsid, wodurch möglicherweise auch der Zusammenhalt der reifen Viruspartikel sichergestellt ist (STRICKER et al., 1994).
Der Mechanismus der Ausstülpung der Zellmembran und der Knospung (budding) der Viren ist noch weitgehend ungeklärt. Die Hämagglutinin-Neuraminidase sorgt mit ihrer Neuraminidase-Aktivität für ein Abspalten der Sialinsäuren von der Wirtszelloberfläche und verhindert so eine Reinfektion. Damit wird das Ablösen reifer Viren von der Zelle ermöglicht.
Ein erhöhter Umsatz an M- und HN-Proteinen in der Wirtszelle konnte mit einer starken Reduktion in der Virusausschleusung in Korrelation gebracht werden (ROUX &
WALDVOGEL, 1982; ROUX et al., 1985; TUFFEREAU & ROUX, 1988). Man kann also
vermuten, dass diese Proteine eine entscheidende Rolle bei der Virusausschleusung spielen.
Interessanterweise können temperatursensitive SeV-Mutanten, welche bei nichtpermissiven Temperaturen einen reduzierten HN-Einbau in der Virushülle aufweisen, effizient ausgeschleust werden (STRICKER & ROUX, 1991).
Die Übergänge zwischen den Genen bestehen aus jeweils 50 bis 80 Nukleotiden. In jedem dieser Bereiche findet man eine stark konservierte Region von 22 Nukleotiden, die sich jeweils in drei Abschnitte unterteilen lassen. Die ersten 9 Nukleotide stellen das Terminationssignal des vorangegangenen Gens dar. Die nächsten der Nukleotide werden als intergene Sequenz bezeichnet und nicht transkribiert. Die letzten 10 Nukleotide fungieren als Startsignal für das nachfolgende Gen (GUPTA & KINGSBURY, 1984). Somit ist jeder Genabschnitt von Konsensussequenzen flankiert, welche die Genexpression regulieren.
Das Fusionsprotein von RSV hat im Rahmen der Infektion wichtige Funktionen. Es induziert im Wirtsorganismus die Bildung neutralisierender Antikörper. Weiterhin besitzt es Bindungsvermögen an Heparinstrukturen auf dem Wirt und ist so in der Lage, unabhängig von anderen Oberflächenproteinen, die Infektion zu vermitteln. Schließlich leitet es die Fusion von Virushülle und Plasmamembran der Zielzelle ein. Essentiell für die Funktionstüchtigkeit des Fusionsproteins ist die proteolytische Spaltung durch Furin-ähnliche Proteasen an einem multibasischen Spaltmotiv. Furin ist ubiquitär vorhanden, so dass die Aktivierung von RSV-F in nahezu jeder Zelle, also auch in Zellkultur, erfolgt.
Um einzelne Virusproteine des respiratorischen Synzytialvirus zu untersuchen, greift man meist auf ein Plasmid-Vektor-System zurück, mit dem Einzel- oder Koexpressionen von Virusproteinen durchgeführt werden können (HEMINWAY et al., 1994; PASTEY &
SAMAL, 1997; TENG & COLLINS, 1998).
Als Alternative zu diesem Verfahren wurde ein rekombinantes Sendai-Virus hergestellt, in dessen Genom das Gen für das Fusionsprotein von RSV zusätzlich eingebaut ist. Das entsprechende System wurde vor einigen Jahren im Bereich der SeV-Forschung etabliert, mit dessen Hilfe rekombinante, infektiöse Sendai-Viren aus Plasmid-kodierter cDNA hergestellt werden konnten (GARCIN et al., 1995). Sendai-Viren infizieren Mäuse und andere Kleinnager. Sie besitzen ebenso wie RSV ein Fusionsprotein, welches Antigen- und Fusionseigenschaften besitzt. Es wird allerdings nicht in jeder Zelle gespalten und damit aktiviert. Natürlicherweise wird es außerhalb der Wirtszelle von trypsinähnlichen Proteasen wie der Tryptase Clara in den Lungen von Mäusen aktiviert. In Zellkultur ist es notwendig, exogenes Trypsin bei Infektionsversuchen mit dem Sendai-Virus in das Medium zu geben. Es ist so möglich, bei dem rekombinanten Konstrukt das Sendai-Fusionsprotein nach Belieben durch Trypsin zu aktivieren. Die Infektionswege über das RSV-Fusionsprotein bzw. über das Sendai-Fusionsprotein lassen sich auf diese Weise voneinander unterscheiden. Als Kontrolle wurde anstelle des Gens für RSV-F das Gen für den Farbstoff DsRed eingebaut, welcher in
der Natur von der Scheibenanemone Discosoma ssp. gebildet wird. Dieser Farbstoff wird zytosolisch exprimiert und soll das Sendai-Virus in seiner Funktion nicht beeinträchtigen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, dieses rekombinante Sendai-Virus zu analysieren und die Wirkungsweise des RSV-F im Zusammenhang mit einer SeV-Infektion zu untersuchen, speziell im Hinblick auf die Expression des Fremdgenes und auf dessen Funktionalität (Fusionseigenschaft, Rezeptorbindung). Das zusätzliche Fusionsprotein war ein chimäres Konstrukt, bei dem nur die Ektodomäne dem RSV-Fusionsprotein entstammte, der Transmembrananker und der zytoplasmatische Abschnitt aber dem SeV-Fusionsprotein. Es war zu untersuchen, ob die chimären Anteile des Fusionproteins wichtig waren für den Einbau in Sendai-Virionen.
Der Einbau von Glykoproteinen mit multibasischer Spaltstelle in Sendai-Viren würde außerdem eine Vereinfachung zur Herstellung schwer amplifizierbarer Viren darstellen, da während der Virusvermehrung auf die Zugabe von Trypsin zur Aktivierung des SeV-Fusionsproteins verzichtet werden könnte. Dieser Aspekt wäre eine Hilfe bei der Entwicklung von Sendai-Virus-Vektoren für die Gentherapie. Auch im Hinblick auf einen Tierversuch ist dieses Konstrukt interessant. Es ist denkbar, mit diesem attenuierten Virus Mäuse zu infizieren und damit das RSV-F als Hauptantigen des respiratorischen Synzytialvirus im Mausmodell zu untersuchen. Da das Sendai-Virus kein humanpathogenes Potential besitzt, ist es denkbar, mit ihm RSV-Antigene in einen Wirtsorganismus zur Induktion einer Antikörper-Bildung einzuschleusen. Somit ließen sich weiterhin grundlegende Ergebnisse zur Entwicklung von Impfstoffen ermitteln.
In der vorliegenden Arbeit wurde mit den folgenden permanenten Monolayer-Zelllinien gearbeitet:
Vero-Zellen
Diese Zellen stammen aus dem Nierengewebe der Grünen Meerkatze (African green monkey kidney). Die etablierte Zelllinie wurde vom Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
BHK21-Zellen
Hierbei handelt es sich um eine etablierte Zelllinie aus Nierengewebe von jungen syrischen Goldhamstern (baby hamster kidney). Sie stammt aus der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig. Katalognummer: DSM ACC 61 und wurde durch das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
MDCK-II-Zellen
Ursprünglich stammt diese etablierte Zelllinie aus Nierengewebe von Hunden (Madin Darby Canine Kidney). Auch sie wurde durch das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
3.2 Zellkulturmedien
Medium für VERO-Zellen
Edulb mit Antibiotikazusatz, hergestellt durch das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Hinzugefügt wurde vor Gebrauch 4% Fetales Kälberserum (1 h bei 56°C inaktivert), Fa.
Biochrom KG, Berlin
Medium für BHK21-Zellen bzw. für MDCK-II-Zellen
EMEM (Earl’s Minimum Essential Medium), hergestellt durch das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Hinzugefügt wurde vor Gebrauch 4% Fetales Kälberserum (1 h bei 56°C inaktivert) der Firma Biochrom KG, Berlin.
Methylcellulose-haltiges Medium
In einer 500 ml-Flasche mit einem Magnetrührstab wurden zunächst 4 g Methylcellulose autoklaviert. Dann wurden unter sterilen Bedingungen 500 ml EMEM bzw. Edulb hinzugegeben. Die Zutaten wurden etwa zwei Tage bei 4°C auf einem Magnetrührer miteinander vermengt.
3.3 Erythrozyten
Hühnererythrozyten wurden aus der Klinik für Geflügel, Abteilung Wirtschaftsgeflügel, der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
3.4 Viren
Humanes respiratorisches Synzytialvirus (HRSV)
Der Stamm Long wurde ursprünglich von Herrn Streckert, Universität Bochum, zur Verfügung gestellt.
Rekombinante Sendai-Viren
Der Stamm Fushimi (SeV D 52) wurde von Herrn Prof. Neubert, Max-Planck-Institut für Biochemie, Abteilung Molekulare Virologie, Martinsried, zur Verfügung gestellt.
Die Konstrukte der drei rekombinanten Sendai-Viren DsRed, RSV-Fch und rSeV-RSV-Fnat (vgl. Abbildung 6) wurden durch Herrn Dr. Zimmer, Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und durch Herrn Dr. Sascha Bossow, Max-Planck-Institut für Biochemie, Abteilung Molekulare Virologie, Martinsried, entwickelt und zur Verfügung gestellt. Die drei Transgene wurden jeweils über die Schnittstellen MlUI und BssHII in das Genom des Sendai-Virus zwischen die Genabschnitte für das P-Protein und für das M-Protein eingebaut. Die Abbildung 6 zeigt ein Schema der Genome für die drei verschiedenen Konstrukte. Die Nukleotidsequenz des chimären Fusionsproteins RSV-Fch des Virus rSeV-RSV-Fch ist im Anhang einzusehen.
Abbildung 6: Schema der Genome der drei rekombinanten Viren
1.) RSeV-RSV-Fch, rekombinantes Sendai-Virus mit Genabschnitt für die Ektodomäne von RSV-F (1), den Transmembrananker (2) und den zytoplasmastischen Abschnitt (3) des Sendai-F
2.) RSeV-RSV-Fnat, rekombinantes Sendai-Virus mit Genabschnitt für das gesamte, native RSV-F
3.) RSeV-DsRed, rekombinantes Sendai.Virus mit Genabschnitt für DsRed, einen Fluoreszenz-Farbstoff der Scheibenanemone Discosoma ssp.
3‘ N P X M F HN L 5‘
RSV-F
3‘ N P X M F HN L 5‘
DsRed
3‘ N P X M F HN L 5‘
1 2 3 RSV-Fch 1.)
2.)
3.)
3.5 Erstantikörper
Anti-RSV-F (Mab Biosoft) Fa. Biosoft, Varilhes, Frankreich
Anti-RSV-F (Mab Melero) zur Verfügung gestellt von Herrn José Antonio Melero, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien
Anti-RSV-F (Mab Örvell) zur Verfügung gestellt von Herrn Claes Örvell, Karolinska Institutet, Department of Microbiology, Pathology + Immunology, Huddinge, Schweden
Anti-RSV-F
(Mab 4, 13, 19) zur Verfügung gestellt von Frau Geraldine Taylor, Institute for Animal Health, Compton, Vereinigtes Königreich
Anti-MBP-F2 zur Verfügung gestellt von Herrn Dr. Zimmer, Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Sendai-Antiserum zur Verfügung gestellt von Herrn Dr. Zimmer, Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Anti-Sendai-HN zur Verfügung gestellt von Herrn Prof. Neubert, Max-Planck-Institut für Biochemie, Abteilung Molekulare Virologie, Martinsried
Anti-Sendai-F zur Verfügung gestellt von Herrn Prof. Neubert, Max-Planck-Institut für Biochemie, Abteilung Molekulare Virologie, Martinsried
Anti-Parainfluenzavirus 1 Fa. DPC Biermann, Bad Nauheim
3.6 Zweitantikörper
Anti-Maus-POD Fa. DAKO, Hamburg
Anti-Maus-FITC Fa. Amersham, Freiburg
Anti-Kaninchen-POD Fa. Sigma, Steinheim
Anti-Kaninchen-FITC Fa. Amersham, Freiburg
3.7 Kits
Silver Stain Kit Fa. BIO-RAD, München
BCA-Protein-Assay Fa. Pierce, Bonn
3.8 Enzyme
Neuraminidase aus V. cholerae Fa. DADE BEHRING, Marburg Trypsin, acyteliert, aus bovinem Pankreas Fa. Sigma, Steinheim
3.9 Substrate/Marker
Rainbow Marker Fa. Amersham, Freiburg
AEC (5-Amino-9-ethylcarbazol) Fa. Sigma, Steinheim BM Chemoluminescence
Blotting Substrate (POD) Fa. Roche, Mannheim
Super Signal® West Dura Extended
Duration Substrate Fa. Pierce, Bonn
3.10 Chemikalien
Acrylamidlösung 30% „rotiphorese® Gel 30“ Fa. Merck, Darmstadt
Aminocapronsäure Fa. Sigma, Steinheim
Amoniumpersulfat (APS) Fa. BIO-RAD, München
Blocking-Reagenz Fa. Roche, Mannheim
Bromphenolblau Fa. Merck, Darmstadt
Calciumchlorid (CaCl2 x 2 H2O) Fa. Roth, Karsruhe Coomassie-Brilliantblau Fa. Merck, Darmstadt 1,4-Diazobicyclo-[2.2.2]-oktan (DABCO) Fa. Sigma, Steinheim 1,4-Dithiotreiol (DTT) Fa. Roth, Karlsruhe Dimethylsulfoxid (DMSO) Fa. Roth, Karlsruhe Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4 x 12 H2O) Fa. Merck, Darmstadt Dimethylformamid (DMF) Fa. Merck, Darmstadt
Essigsäure Fa. Roth, Karlsruhe
Ethanol Fa. Merck, Darmstadt
Fetales Kälberserum (FKS) Fa. Biochrom, Berlin Ganglioside, gereinigt, aus Rinderhirn Fa. Sigma, Steinheim
Glycerin Fa. Roth, Karlsruhe
Glycin Fa. Roth, Karlsruhe
Isopropanol Fa. Roth, Karlsruhe
Kaliumchlorid (KCl) Fa. Roth, Karlsruhe
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Fa. Merck, Darmstadt Magnesiumchlorid (MgCl2 x 6 H2O) Fa. Roth, Karlsruhe Methylcellulose (2.000 centipodes) Fa. Sigma, Steinheim
Mowiol 4-88 Fa. Calbiochem, Darmstadt
Natriumacetat Fa. Merck, Darmstadt
Natriumchlorid (NaCl) Fa. Roth, Karlsruhe
Natriumdodecylsulfat (SDS) Fa. Roth, Karlsruhe N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Fa. Roth, Karlsruhe
Paraformaldehyd Fa. Fluka, Neu-Ulm
Saccharose Fa. Roth, Karlsruhe
Salzsäure Fa. Roth, Karlsruhe
Stickstoff, flüssig Fa. Messer-Griesheim, Krefeld Tris-Hydroxymethylaminmethan (TRIS) Fa. Roth, Karlsruhe
Tween-20 Fa. Roth, Karlsruhe
Wasserstoffperoxid (H2O2), 30% Fa. Merck, Darmstadt
3.11 Puffer und Lösungen
AEC (5-Amino-9-ethylcarbazol)-Lösung (1,85 ml)
AEC-Puffer (0,05 M Natriumacetat, pH 5,0) 1,7 ml AEC-Subtrat
(0,66% AEC in Dimethylformamid (DMF) 0,1 ml
H2O23% 1 Tropfen (0,05 ml)
10 x SDS-Laufpuffer für Polyacrylamidgele
SDS 10 g
TRIS 30 g
Glycin 144 g
Mit H2O auf 1 l aufgefüllt
3% Paraformaldehyd (pH 7,4)
3 g Paraformaldehyd werden in 100 ml PBSM bei 80°C gelöst, steril filtriert und bei –20°C gelagert
2 x SDS-Probenpuffer für Proteingele
TRIS/HCl 100 mM
SDS 4%
Glycerin 20%
Bromphenolblau 0,02%
eingestellt auf pH 6,8
Anodenpuffer I für Semi-Dry-Western-Blot
TRIS/HCl 300 mM
Ethanol 20%
eingestellt auf pH 9,0
Anodenpuffer II für Semi-Dry-Western-Blot
TRIS/HCl 25 mM
Ethanol 20%
eingestellt auf pH 7,4
Kathodenpuffer für Semi-Dry-Western-Blot
TRIS/HCl 25 mM
Ethanol 20%
Aminocapronsäure 40 mM
eingestellt auf pH 9,0
1 M DTT-Lösung
3,09 g DTT wurden in 20 ml einem 0,01 M Natriumacetat-Puffer gelöst.
Mowiol
Mowiol 4-88 12%
Glycerin 30%
1,4-Diazobicyclo-[2.2.2]-oktan (DABCO) 2,5%
TRIS/HCl 0,12 M
eingestellt auf pH 8,5
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)
NaCl 8,00 g
KCl 0,20 g
Na2HPO4 x 12 H2O 1,15 g
KH2PO4 0,20 g
MgCl2 x 6 H2O 0,10 g
CaCl2 x 2 H2O 0,132 g
Reinstwasser ad 1 l
pH 7,5
PBSM
wie PBS, allerdings ohne CaCl2 und MgCl2, pH 7,5
PBSM 0,1% Tween-20
zu 1 l PBSM wurde 1 ml Tween-20 gegeben
PBSM 0,05% Tween-20
zu 1 l PBSM wurden 0,5 ml Tween-20 gegeben
Glycin-Lösung (0,1 mol/l)
Glycin 0,75 g
PBSM 100 ml
Sammelgellösung für Polyacrylamidgele (5 ml Ansatz)
H2O 3,4 ml
TRIS-HCl 1 M pH 6,8 0,63 ml
Acrylamidlösung 30% 0,83 ml
SDS 10% (in H2O) 50 µl
APS 10% (in H2O) 50 µl
TEMED 10 µl
Trenngellösung (10%) für Polyacrylamidgele (10 ml Ansatz)
H2O 4,0 ml
TRIS-HCl 1,5 M pH 8,8 2,5 ml
Acrylanidlösung 30% 3,3 ml
SDS 10% (in H2O) 100 µl
APS 10% (in H2O) 100 µl
TEMED 16 µl
Coomassie-Färbelösung
Coomassie-Brilliantblau 0,5 g
Ethanol 200 ml
konz. Essigsäure 50 ml
H2O 250 ml
Entfärbelösung/Fixierlösung für Proteingele
Ethanol 400 ml
konz. Essigsäure 100 ml
H2O 500 ml
Saccharose-Gradient
60%ige Saccharose-Lösung: 6 g Saccharose zu 4 ml PBSM 50%ige Saccharose-Lösung: 5 g Saccharose zu 5 ml PBSM 20%ige Saccharose-Lösung: 2 g Saccharose zu 2 ml PBSM
3.12 Geräte und sonstige Materialien
Immunfluoreszenz
Deckgläschen Fa. Superior Marienfeld, Lauda-Königshofen
Objektträger Fa. Roth, Karlsruhe
Parafilm® Fa. Roth, Karlsruhe
Mikroskope
Leitz Lichtmikroskop Fa. Leitz, Wetzlar Fluoreszenzmikroskop Axiophot 2 Fa. Zeiss, Jena
Pipetten und Pipettierhilfen
Pipetten (Volumen 10 µl, 100 µl, 1000 µl) Fa. Eppendorf, Hamburg Accu-Jet® Pipettenhelfer Fa. Brand, Wertheim/Main
VacuSafe Absaugsystem Fa. Integra Biosciences, Fernwald Pasteurpipetten aus Glas Fa. H. Jürgens, Hannover
Glaspipetten
(Volumen 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml) Fa. H. Jürgens, Hannover
Einmal-Pipettenspitzen (10 µl) Fa. Biozym, Hessisch Oldendorf Einmal-Pipettenspitzen (100 µl, 1000 µl) Fa. Ratiolab, Dreieich
Einmal-Pipettenspitzen, gestopft
(10 µl, 100 µl, 1000 µl) Fa. Biozym, Hessisch Oldendorf
Aspirette® Fa. Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt
SDS-Gelelektrophorese
Gelgießvorrichtung Fa. von Keutz, Reiskirchen Gelträger und Kammer Fa. von Keutz, Reiskirchen Elektrophoresekammer Fa. von Keutz, Reiskirchen Kämme, Spacer Fa. von Keutz, Reiskirchen Spannungsquelle
BIO-RAD Power Pac 200/300 Fa. BIO-RAD, München
Waagen
Elektron. Analysenwaage, Typ 1712 MP 8 Fa. Sartorius, Göttingen Sartorius Portable Waage Fa. Sartorius, Göttingen
Wasserbäder
Lauda A100 Fa. Lauda, Königshofen
GFL Wasserbad Fa. GFL, Burgwedel
Western Blot
Filterpapier Fa. Schleicher & Schuell, Dassel Nitrocellulose-Transfer-Membran Fa. Schleicher & Schuell, Dassel
Transferkammer Fa. von Keutz, Reiskirchen
Zellkultur
große Kulturflaschen, 175 cm2, 650 ml Fa. Greiner, Frickenhausen mittlere Kulturflaschen, 75 cm2 Fa. Nunc, Wiesbaden kleine Kulturflaschen, 25 cm2 Fa. Nunc, Wiesbaden
24-well-Platten Fa. Greiner, Frickenhausen Mikrotiterplatten (96-well) Fa. Greiner, Frickenhausen Kryoröhrchen Fa. Greiner, Frickenhausen Neubauer-Zählkammer Fa. La fontaine, Forst
Petrischalen 145/20 Fa. Greiner, Frickenhausen Mikrotiterplatten (96 well) U-Form Fa. Nunc, Wiesbaden
CO2-Brutschrank Fa. Heraeus, Osterode Strata Cooler® Cryo Preservation Module Fa. Stratagene, Niederlande
Zentrifugation
Ultra-Zentrifuge L8-70M und Rotoren Fa. Beckman, München Zentrifugenröhrchen
Ultra Clear, 13 x 51 mm Fa. Beckman, München
Polyallomer, 25 x 89 mm Fa. Beckman, München
Spritze Omnifix®-F 1 ml Fa. Braun, Melsungen
Kanülen Fa. Braun, Melsungen
Zentrifugenröhrchen 15 ml, 50 ml Fa. Greiner, Frickenhausen Tischzentrifugen (5417R, 5417C) Fa. Eppendorf, Hamburg
Megafuge 1,0R Fa. Heraeus, Hamburg
sonstige Geräte
ChemiDocTMSystem Fa. BIO-RAD, München
ELISA Reader, Spectra SLT Fa. TECAN, Crailsheim Kühl- und Gefriergeräte Fa. Liebherr, Lientz
Autoklav Webeco Fa. H. Jürgens, Hannover pH-Meter Fa. H. Jürgens, Hannover RCT basic Magnetrührer Fa. IKA Labortechnik, Staufen Schwenktisch 3012 Fa. GFL, Burgwedel Thermoblock Fa. Liebisch, Bielefeld Thermomixer Kompakt Fa. Eppendorf, Hamburg
4.1.1 Passagieren von MDCK II Zellen
MDCK-II-Zellen wurden in EMEM, versetzt mit Antibiotikalösung und 4% FKS, kultiviert.
Die Passagierung erfolgte im Drei- bzw. Viertagesrhythmus in 75 cm2-Kulturflaschen. Der adhärente Zellrasen wurde zweimal zwei Minuten lang mit PBSM gewaschen. Nach Entfernen der Waschflüssigkeit wurden die Zellen zwei Minuten lang mit 10 ml Trypsin inkubiert. Anschließend wurden 9 ml Trypsin abgenommen und die Kulturflasche für etwa 15 Minuten mit dem verbleibenden 1 ml in den Brutschrank (37°C, 5% CO2-Begasung) gestellt.
Die abgelösten Zellen konnten dann mit 10 ml Nährmedium resuspendiert werden. Von dieser Zellsuspension wurden 0,5 ml zusammen mit 20 ml neuem Kulturmedium in die Kulturflasche gegeben (1:20 Umsetzung). Diese wurde bei 37°C und 5% CO2-Begasung inkubiert. Die restlichen abgelösten Zellen konnten für Versuche genutzt werden.
4.1.2 Passagieren von Vero-Zellen
Die Vero-Zellen wurden in Edulb, versetzt mit Antibiotikalösung und 4% FKS, kultiviert. Die Passage erfolgte analog zu den MDCK-II-Zellen, allerdings genügte eine Trypsinierungszeit von 10 Minuten zum Ablösen der Zellen. Die Umsetzung erfolgte ebenfalls 1:20.
Die Vero-Zellen wurden in Edulb, versetzt mit Antibiotikalösung und 4% FKS, kultiviert. Die Passage erfolgte analog zu den MDCK-II-Zellen, allerdings genügte eine Trypsinierungszeit von 10 Minuten zum Ablösen der Zellen. Die Umsetzung erfolgte ebenfalls 1:20.