der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Charakterisierung des Fusionsproteins des respiratorischen Synzytialvirus mit Hilfe rekombinanter Sendai-Viren
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Matthias Hinz aus Heide/Holstein
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Georg Herrler
1. Gutachter: Prof. Dr. Georg Herrler
2. Gutachterin: Prof. Dr. Edda Töpfer-Petersen
Tag der mündlichen Prüfung: 20. November 2003
Meinen Eltern
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1 EINLEITUNG ... 1
1.1 DAS RESPIRATORISCHE SYNZYTIALVIRUS... 1
1.1.1 Taxonomie ... 1
1.1.2 Verbreitung, Pathogenität und Epidemiologie... 3
1.1.3 Klinik und Pathologie... 4
1.1.4 Immunologie... 5
1.1.5 Morphologie ... 6
1.1.6 Strukturproteine ... 9
1.1.6.1 Nukleokapsid-assoziierte Proteine ... 9
1.1.6.2 M-Protein ... 10
1.1.6.3 SH-Protein... 11
1.1.6.4 G-Protein ... 11
1.1.6.5 F-Protein... 13
1.1.7 Nichtstrukturproteine ... 16
1.1.8 Genomstruktur und Virusvermehrung... 16
1.2 DAS SENDAI-VIRUS... 18
1.2.1 Taxonomie ... 18
1.2.2 Medizinische Bedeutung des Sendai-Virus ... 19
1.2.3 Morphologie ... 20
1.2.4 Oberflächenproteine... 22
1.2.4.1 HN-Protein ... 22
1.2.4.2 F-Protein... 23
1.2.5 Spaltung des F-Proteins ... 25
1.2.6 Genomstruktur und Virusvermehrung... 27
2 ZIELSETZUNG ... 30
3 MATERIAL... 32
3.1 ZELLLINIEN... 32
3.2 ZELLKULTURMEDIEN... 33
3.3 ERYTHROZYTEN... 34
3.4 VIREN... 34
3.5 ERSTANTIKÖRPER... 36
3.6 ZWEITANTIKÖRPER... 37
3.7 KITS... 37
3.8 ENZYME... 37
3.9 SUBSTRATE/MARKER... 37
3.10 CHEMIKALIEN... 38
3.11 PUFFER UND LÖSUNGEN... 39
3.12 GERÄTE UND SONSTIGE MATERIALIEN... 43
4 METHODEN ... 47
4.1 ZELLKULTUREN... 47
4.1.1 Passagieren von MDCK II Zellen ... 47
4.1.2 Passagieren von Vero-Zellen ... 47
4.1.3 Passagieren von BHK21-Zellen ... 47
4.1.4 Anlegen von Gefrierkulturen und Auftauen von Zellen... 48
4.2 VERMEHRUNG VON VIRUS IN ZELLKULTUR... 48
4.3 HÄMAGGLUTINATIONSTEST (HA-TEST)... 49
4.4 FIXIEREN VON ZELLEN... 50
4.5 IMMUNOPLAQUETEST... 50
4.6 INFEKTION VON ZELLKULTUR... 52
4.7 IMMUNFLUORESZENZ... 53
4.8 VIRUSREINIGUNG... 54
4.9 PROTEINBESTIMMUNG IM BCA-TEST... 55
4.10 SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE... 56
4.11 WESTERN BLOT,SEMI-DRY-BLOT VON PROTEINEN... 57
4.12 IMMUNCHEMISCHE DETEKTION VON PROTEINEN... 57
4.13 DETEKTION VON PROTEINEN IN POLYACRYLAMIDGELEN... 59
4.13.1 Coomassie-Färbung ... 59
4.15 VIRUSNEUTRALISATIONSTEST... 60
4.16 INKUBATION VON VIRUS MIT NEUTRALISIERENDEN ANTIKÖRPERN... 62
4.16.1 Inkubation mit Antikörpern gegen RSV-F... 62
4.16.2 Inkubation mit polyklonalem Serum gegen Sendai-Virus ... 63
4.17 DESIALYLIERUNG VON ZELLKULTUR... 63
4.18 WIEDERHERSTELLUNG DER SEV-REZEPTOREN IN ZELLKULTUR... 64
5 ERGEBNISSE ... 66
5.1 EXPRESSION DER TRANSGENE DER REKOMBINANTEN SENDAI-VIREN... 66
5.2 EINBAU DER FREMDPROTEINE IN SEV-PARTIKEL... 68
5.2.1 Nachweis des Einbaus mit Hilfe des Western Blots ... 68
5.2.2 Nachweis in Polyacrylamidgelen ... 70
5.3 WACHSTUMSEIGENSCHAFTEN DER REKOMBINANTEN VIREN... 71
5.4 REPLIKATIONSVERHALTEN DER REKOMBINANTEN VIREN... 74
5.5 HEMMUNG DER INFEKTION DURCH NEUTRALISIERENDE ANTIKÖRPER... 76
5.5.1 Neutralisationsvermögen diverser Antikörper gegen RSV-F... 76
5.5.2 Infektionshemmung mit einem Antikörper gegen RSV-F ... 78
5.5.3 Infektionshemmung mit Antikörpern gegen SeV ... 79
5.6 INFEKTIONSVERMÖGEN IN ABHÄNGIGKEIT VON SIALINSÄUREN... 81
5.6.1 Entfernen der Sialinsäuren von Zellkultur ... 81
5.6.2 Wiederherstellung der SeV-Rezeptoren ... 82
6 DISKUSSION ... 85
6.1 EINBAU DES CHIMÄREN FUSIONSPROTEINS IN SENDAI-VIRIONEN... 85
6.2 INFEKTIONSVERMITTLUNG DURCH RSV-F ... 86
6.3 NEUTRALISATION DER INFEKTIONSWEGE... 89
6.4 ABHÄNGIGKEIT DES RSV-F VON SENDAI-HN... 90
6.5 AUSBLICK... 91
7 ZUSAMMENFASSUNG ... 94
8 SUMMARY... 96
9 LITERATURVERZEICHNIS ... 98
TABELLENVERZEICHNIS ... 117
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS... 118
TAGUNGSBEITRÄGE ... 121
DANKSAGUNG ... 122
ANHANG ... 123
1.1.1 Taxonomie
Das respiratorische Synzytialvirus wurde erstmals 1956 als viraler Erreger aus den oberen Atemwegen beschrieben (MORRIS et al., 1956). Man isolierte es aus einem Schimpansen und bezeichnete es als chimpanzee coryza agent (CCA). Ein Jahr später gelang einer anderen Arbeitsgruppe der Nachweis eines solchen Virus beim Menschen. Es wurde als humanes respiratorisches Synzytialvirus (HRSV) bezeichnet (CHANOCK et al., 1957).
Auch bei anderen Spezies wurden verwandte Viren nachgewiesen. In der Schweiz gelang Paccaud und Jaquier 1967 die Isolierung des bovinen respiratorischen Synzytialvirus bei Rindern (PACCAUD & JACQUIER, 1970). Dieses Virus zeigt neben serologischer Verwandtschaft zu HRSV (ORVELL et al., 1987; WALRAVENS et al., 1990) auch sehr ähnliche klinische Symptome und eine ähnliche Pathologie (COLLINS et al., 2001). Es wird bei Kälbern und Kindern ein vergleichbares Krankheitsbild durch diese Viren hervorgerufen.
Experimentell lassen sich Kälber mit aus Menschen isoliertem Virus infizieren (JACOBS &
EDINGTON, 1975). Bei Ziegen und Schafen konnte ein zwar serologisch verwandtes, aber nicht identisches respiratorisches Synzytialvirus nachgewiesen werden. Es gibt also auch eine caprine (CRSV) und eine ovine (ORSV) Virusspezies des RSV (SMITH et al., 1975;
TRUDEL et al., 1989; MALLIPEDDI & SAMAL, 1993).
Bei Infektionen von Zellkulturen lässt sich die für RSV typische Synzytienbildung beobachten (COLLINS, 1991). Die Fusionseigenschaften des Virus bewirken die Bildung von mehrkernigen Riesenzellen. Im Grunde verschmelzen hier die Zellen zu größeren Konglomeraten, den Synzytien. Dieses Wort stammt vom griechischen „syn“ (=zusammen) und „kytos“ (=Höhlung, Wölbung) und beschreibt gut diesen Charakter.
Tabelle 1: Vertreter der Familie Paramyxoviridae
Subfamilie Genus Tier Mensch
Paramyxovirinae Respirovirus bovines
Parainfluenzavirus Typ3 Sendai-Virus
Parainfluenzavirus Typ1 und 3
Rubulavirus Simian-Virus 5 Mumpsvirus Parainfluenzavirus Typ 2 und 4a,b Avulavirus Newcastle-Disease-Virus
Paramyxovirus 1 der Taube
Paramyxovirus 3 der Pute Morbillivirus Hundestaupevirus
Robbenstaupevirus Rinderpestvirus Pest-des-Petits-
Ruminants-Virus (PPRV)
Masernvirus
Henipavirus Hendravirus (Pferd) Menanglevirus (Schwein) Nipahvirus
(Schw., Hund)
Hendravirus Nipahvirus
Pneumovirinae Pneumovirus BRSV (Rind) ORSV (Schaf) CRSV (Ziege)
Pneumovirus der Maus (PVM)
humanes respiratorisches Synzytialvirus (HRSV)
Metapneumovirus Rhinotracheitisvirus der Pute (TRTV)
Humanes
Metapneumovirus
Die vier Spezies der respiratorischen Synzytialviren gehören zusammen mit dem Pneumovirus der Maus (PVM) zum Genus Pneumovirus. Gemeinsam werden sie zur Familie Paramyxoviridae (vgl. Tab.1) (COLLINS et al., 2001) und zur Ordnung Mononegavirales (PRINGLE, 1999) gerechnet.
1.1.2 Verbreitung, Pathogenität und Epidemiologie
Nach der Isolierung von RSV aus respiratorisch erkrankten Rindern, basierend auf den Erkenntnissen von Paccaud und Jacquier (1970), erschienen Berichte über Ausbrüche RSV- bedingter Erkrankungen in England, den USA, Japan, Kanada, Belgien, Ungarn, den Niederlanden, Norwegen, Schweden, Dänemark u. a. (INABA et al., 1970; JACOBS &
EDINGTON, 1971; SMITH et al., 1975; BITSCH et al., 1976; HOLZHAUER et al., 1976;
ODEGAARD & KROGSRUD, 1977; BRYSON et al., 1979; THOMAS et al., 1980;
ELAZHARY et al., 1980; PIRIE et al., 1981; PRITCHARD & EDWARDS, 1981;
FLORENT et al., 1985; HARRISON & PURSELL, 1985; LINGGI & WYLER, 1985;
WELLEMANS & VAN OPDENBOSCH, 1985). Infektionsversuche führten zu klinischen Erkrankungen und erfüllten so für RSV die Henle-Kochschen Postulate (VERHOEFF et al., 1984), d. h. dass sich mit dem regelmäßig in betroffenen Tieren nachgewiesenen und in Reinkultur anzüchtbaren Erreger das entsprechende Krankheitsbild auch reproduzieren lässt.
In der Bundesrepublik wurden zunächst in Bayern serologische Erhebungen vorgenommen.
Es konnte auf eine starke Verbreitung von BRSV im Freistaat geschlossen werden (NIEMEYER, 1976). Nach gehäuftem Auftreten von respiratorischen Erkrankungen bei Rindern in Schleswig-Holstein ab 1984 wurde auch hier BRSV als infektiöse Ursache ermittelt (STEINHAGEN, 1987). Epidemiologische Untersuchungen zeigten, dass über 70%
der Rinder in Deutschland Antikörper gegen das Virus besitzen (LOTTHAMMER &
EHLERS, 1990).
Die Infektion mit BRSV verläuft häufig in Gesellschaft mit anderen bakteriellen (Pasteurellen, Chlamydien und Mykoplasmen) und viralen Erregern (bovine Adenoviren,
bovines Herpesvirus 1, Virus der bovinen Virusdiarrhoe, Parainfluenzavirus 3, bovine Rhinoviren 1 und 2, Coronaviren, Reoviren). Man spricht von einer Faktorenkrankheit. Es konnte beobachtet werden, dass das Virus nicht nur in Mast- und Zukaufsbetrieben auftaucht, sondern auch in Milchbetrieben, in denen seit Jahren kein Zukauf erfolgte (STEINHAGEN, 1990). Hauptreservoir von BRSV ist das Rind, allerdings lassen sich experimentell auch Schafe infizieren (SHARMA & WOLDEHIWET, 1992). Es erkranken hauptsächlich Jungrinder im Alter von vier Wochen bis sechs Monaten (BRYSON et al., 1983; KIMMAN et al., 1988). Beim Aufstallen im Herbst und Winter führen nasskaltes Klima und enger Tierkontakt zu gehäuften Infektionen (BAKER et al. 1986 b).
Die Übertragung von RSV erfolgt aerogen durch Tröpfcheninfektion. Das Virus gelangt hierbei in den oberen Respirationstrakt, vermehrt sich in den Zellen des Schleimhautepithels und breitet sich von hier aus schnell in die unteren Atemwege aus. BRSV wird noch etwa drei Wochen nach Infektion vom betroffenen Tier ausgeschieden (LIEBERMANN, 1992).
Die humane Spezies des respiratorischen Synzytialvirus, HRSV, hat große Bedeutung in der Pädiatrie. Sie gilt als wichtigster viraler Erreger des unteren Respirationstraktes bei Kleinkindern und tritt weltweit auf (HEILMANN, 1990). Säuglinge in einem Alter von sechs Wochen bis zu einem halben Jahr, aber auch ältere Menschen und Personen, die unter einer Immunsuppression leiden, sind besonders gefährdet (THORSEN et al., 2000; COLLINS &
POLLARD, 2002). HRSV-Infektionen sind hochansteckend. Man findet 106 infektiöse Einheiten pro Milliliter Nasenflüssigkeit (COLLINS, 1995). Die Infektion erfolgt aerogen oder durch direkten Kontakt mit den erkrankten Personen. Die Inkubationszeit beträgt drei bis fünf Tage. Über 80% der Kinder unter vier Jahren haben bereits Antikörper gegen HRSV.
1.1.3 Klinik und Pathologie
Bei der BRSV-Infektion unterscheidet man zwei Verlaufsformen. Der gutartige Verlauf ist durch ein geringgradig gestörtes Allgemeinbefinden, leichtes Fieber und Nasenausfluss gekennzeichnet. Es kommt zum Ausheilen nach etwa drei Tagen. Es kann aber circa eine
Woche später die Ausprägung des zweiten Stadiums folgen. Es kommt zu hohem Fieber bis 42°C, schaumigem Speicheln, Tachypnoe bei fehlendem Nasenausfluss bis hin zu starker Dyspnoe mit typischer Maulatmung und gestrecktem Hals. Die Tiere werden anorektisch, leiden unter Obstipation, und der Kliniker findet Emphyseme in der Schulter- und Halsgegend des betroffenen Tieres. Es ist meist der gesamte Bestand betroffen, wobei die Letalität bei 20 bis 30% liegt. Zwei bis drei Monate nach der Erstinfektion trifft man bei erneut infizierten Tieren auch eine subklinische Verlaufsform an (INABA et al., 1970; LIEBERMANN, 1992;
BELKNAP, 1993).
Der Pathologe findet bei betroffenen Tieren Lungenemphyseme und Lungenödeme vor. Das histologische Bild zeigt eine Tracheobronchitis, Bronchiolitis und eine interstitielle Pneumonie mit Synzytien und eosinophilen Einschlusskörperchen (LIEBERMANN, 1992).
In der Kinderheilkunde spricht man bei HRSV vom infektiologischen Hauptproblem des ersten Lebensjahres. Die Erkrankung kann stark in ihrer Ausprägung variieren. Sie kann sich lediglich als leichter grippaler Infekt äußern oder nach zwei Tagen auch zu einer Pharyngitis, Tracheitis oder Bronchitis führen (CHANOCK & PAROTT, 1965; ANDERSON et al., 1990) Etwa 40% der erkrankten Kinder entwickeln eine Bronchiolitis oder auch eine Pneumonie.
Bei 5% der Betroffenen entwickelt sich der Pseudokrupp. Klinisch zeigt sich Heiserkeit, bellender Husten, Zyanose und Fieber. Als Komplikation kann sich eine Mittelohrentzündung entwickeln. Das pathologische Bild ähnelt dem der BRSV-Infektion. Bei Kindern, die einer Risikogruppe angehören, wie etwa Patienten mit Herzfehlern oder bronchopulmonaler Dysplasie, kann die Infektion lebensbedrohlich sein (COLLINS, 1995).
1.1.4 Immunologie
Die RSV-Infektion hinterlässt keine belastbare Immunität. Bei Kälbern verlaufen Reinfektionen symptomlos, bei Kindern hingegen ist die Wiedererkrankung klinisch erkennbar (HALL et al., 1978; BAKER et al., 1986 a). Zugelassene Vakzine gegen HRSV sind momentan nicht auf dem Markt. Formalin-inaktivierte Impfstoffe erwiesen sich als
ungeeignet. Sie waren nicht in der Lage, die Bildung neutralisierender Antikörper zu induzieren und haben eine Wildtypinfektion eher negativ beeinflusst, da es zu verstärkten Krankheitssymptomen kam (KIM et al., 1969; MURPHY & WALSH, 1988). Im Tierversuch mit Ratten konnte gezeigt werden, dass es nach einer Verabreichung Formalin-inaktivierter RSV-Vakzine und anschließender RSV-Infektion zu einer allergischen Reaktion des Typs III, zum Arthus-Phänomen bzw. zur Hypersensitivität, kommt (PRINCE et al., 1986).
Lebendimpfstoffe mit attenuierten Viren sind in der Entwicklung, allerdings ist eine ausgewogene Balance zwischen Attenuierung und Induktion einer protektiven Immunantwort noch nicht erreicht (WRIGHT et al., 2000). Eine Behandlung der RSV-Infektion bei Kindern erfolgt durch Sauerstoff-Therapie. Prophylaktisch wird bei prädisponierten Patienten eine passive Immunisierung durchgeführt.
Eine Protektion durch passive Immunisierung mit monoklonalen Antikörpern gegen das Fusionsprotein von BRSV konnte auch bei Kälbern gezeigt werden (THOMAS et al., 1998).
Gegen BRSV sind Lebend- und Totvakzine im Handel erhältlich. Deren Wirkung und Nutzen hingegen wird kontrovers diskutiert (KIMMAN et al., 1989; ELLIS et al., 1995; WOOLUMS et al., 1999).
1.1.5 Morphologie
RSV ist ein RNA-Virus. Sein Genom ist nicht segmentiert, linear, einzelsträngig und liegt in Negativstrangorientierung vor. Die Nukleinsäure besteht aus 15222 Basenpaaren (COLLINS et al., 2001). Das Virion ist vielgestaltig, filamentös oder sphärisch. Sphärische Partikel variieren im Durchmesser von 150 bis 300 nm. Filamentöse Virionen erreichen Durchmesser von 60 bis 100 nm und eine Länge bis zu 10 µm (JONCAS et al., 1969; ITO et al., 1973).
Abbildung 1 zeigt den schematischen Aufbau eines RSV-Partikels.
Abbildung 1: schematische Darstellung des respiratorischen Synzytialvirus
Es besitzt eine Lipiddoppelmembran, die es durch einen Knospungsprozess an der Plasmamembran der Wirtszelle erhält. Das Genom codiert für 11 verschiedene Virusproteine.
Die Oberflächenproteine von RSV sind das G-, das F- und das SH-Protein, mit der genomischen RNA sind die Proteine L, N und P assoziiert. Ferner gibt es die Proteine M, M2- 1, M2-2 und die Nichtstrukturproteine NS1 und NS2. Tabelle 2 gibt einen kurzen Überblick über die Virusproteine von RSV (COLLINS, 1995; COLLINS et al., 2001).
L-Protein N-Protein P-Protein M-Protein
F-Protein SH-Protein
G-Protein
Tabelle 2: Funktion und Eigenschaft der RSV-Proteine
Protein Molekulargewicht in kDa / Modifkationen
charakteristische Eigenschaften und Funktion F0 70
N-glykosyliert
Vorläufer-Membranprotein, wird gespalten in F1- und F2- Untereinheit
F1 48
N-glykosyliert, acyliert
Typ-I-Membranprotein, carboxyterminale Region von F0, Fusionspeptid am NH2-Ende, Induzierung neutralisierender Antikörper, Bindungseigenschaft, Fusionseigenschaft, über Disulfidbrücken mit F2 zu einem Heterodimer verbunden
F2 20
N-glykosyliert
aminoterminale Region von F0, Signalpeptid am NH2-Ende
G 90
O-/N-glykosyliert
Bindung an Proteoglykane, Transmembranregion am NH2- Ende (Typ-II-Membranprotein),
hoher Kohlenhydratanteil
SH 13 Membranprotein, Funktion unklar
M 25 Matrixprotein, zwischen Nukleokapsid und
Membraninnenseite lokalisiert, initiiert self-assembly N 45 Nukleokapsidprotein, Teil des Polymerasekomplexes P 33, phosphoryliert Teil des Polymerasekomplexes
L 250 Teil des Nukleokapsids, RNA-abhängige RNA-Polymerase M2-1 22, phosphoryliert Elongationsfaktor
M2-2 11 vermittelt Umschaltung von Transkription auf Replikation
NS1 14 Interferon-Antagonist
NS2 15 Interferon-Antagonist
1.1.6 Strukturproteine
1.1.6.1 Nukleokapsid-assoziierte Proteine
Die Proteine N, P, L und M2 sind eng mit dem RSV-Genom assoziiert und bilden gemeinsam mit der RNA das Nukleokapsid. Sie sind als Komplex an der Transkription und Replikation von RSV beteiligt. Das konnte in Transfektionsversuchen gezeigt werden (YUNUS et al., 1998). Hier wurde verdeutlicht, dass ein BRSV-Minigenom mit N, P und L ausreicht, um Transkription und Replikation zu gewährleisten. Unter dem Einfluss von geringen Mengen an M2 wurde die Effektivität dieses Systems noch gesteigert.
Das 42 kDa große Nukleokapsidprotein (N-Protein) als Teil des Polymerasekomplexes ist verantwortlich für die Umschaltung von Transkription zu Replikation. Es interagiert eng mit dem Phosphoprotein (P-Protein) (MALLIPEDDI et al., 1996; KRISHNAMURTHY &
SAMAL, 1998).
Das Phosphoprotein hat ein Molekulargewicht von 27 kDa, ist hydrophil und überwiegend am N-Terminus phosphoryliert. An zwei Regionen des Proteins finden sich gehäuft saure Aminosäuren (SATAKE et al., 1984). Die Phosphoproteine von BRSV und HRSV ähneln sich in der Nukleotidsequenz zu etwa 70%, in der Aminosäuresequenz zu über 80%
(MALLIPEDDI & SAMAL, 1992).
Da das Genom von RSV in Negativstrangorientierung vorliegt, muss das Virus seine eigene RNA-abhängige RNA-Polymerase in die Wirtszelle mitbringen, um einen Positivstrang zu synthetisieren. Diese wird durch das large Protein (L-Protein) repräsentiert (STEC et al., 1991). Es ist 250 kDa groß, besitzt Proteinkinaseaktivität und bindet an das Nukleokapsid- und an das Phosphoprotein (COLLINS et al., 2001). Zwischen BRSV und HRSV stimmt die Nukleotidsequenz des L-Proteins zu 77% überein, die Aminosäuresequenz zu 84% (YUNUS et al., 1998).
Der Polymerasekomplex aus den drei vorgenannten Proteinen wird unterstützt durch das M2- 1-Protein. Der Leserahmen für das M2-Protein überlappt ein kurzes Stück mit dem für das L-
Protein (STEC et al., 1991). Die mRNA für M2 enthält zwei offene Leserahmen (HARDY &
WERTZ, 1998). Der offene Leserahmen für die M2-mRNA kodiert am 5’-Ende (Nukleotide 10-594) für das M2-1-Protein (COLLINS et al., 1990). M2-1 kann an das N-Protein binden und ist intrazellulär kolokalisiert mit N und P (GARCIA et al., 1993; GARCIA-BARRENO et al., 1996). Als Antiterminationsfaktor ist M2-1 wichtig für die Synthese von mRNA in voller Länge (FEARNS & COLLINS, 1999).
Stromabwärts der M2-mRNA (Nukleotide 563-835) befindet sich der offene Leserahmen für das M2-2-Protein (COLLINS et al., 1990). M2-2 hat eine Bedeutung bei der Umschaltung vom Transkriptions- zum Replikationsmodus. Es ist nicht essentiell für das Virus (BERMINGHAM & COLLINS, 1999; JIN et al., 2000).
1.1.6.2 M-Protein
Das Matrixprotein spielt bei den Paramyxoviren eine zentrale Rolle bei der Bildung der Virionen. Es ist sehr basisch, hydrophob und stark konserviert in dieser Virusfamilie (BELLINI et al., 1986; GALINSKI et al., 1987; SPRIGGS et al., 1987). Das Matrixprotein von RSV ist 29 kDa groß und bildet die Proteinschicht an der Innenseite der Virushülle. Ein Signalpeptid oder eine Transmembrandomäne ist in der Sequenz nicht vorhanden. Es spielt eine zentrale Rolle beim Entstehungsprozess des neuen Viruspartikels (self assembly). Schon kurz nach seiner Synthese tritt das Matrixprotein mit der Plasmamembran der Wirtszelle in Interaktion (BOWEN & LYLES, 1982) und zieht im weiteren die übrigen Virusbestandteile für den Knospungsprozess (budding) an der Zellmembran zusammen. Es findet offenbar eine Wechselwirkung mit den viralen Glykoproteinen und dem Nukleokapsid, insbesondere mit dem N-Protein, statt.
1.1.6.3 SH-Protein
Das kleinste der drei Oberflächenproteine des respiratorischen Synzytialvirus ist das small hydrophobic Protein (SH-Protein) mit einem theoretischen Molekulargewicht von 13 kDa.
Bei HSRV wurden unterschiedlich glykosylierte Isoformen nachgewiesen (OLMSTED &
COLLINS, 1989). Die SH-Proteine von HRSV und BRSV sind sehr unterschiedlich. Am C- Terminus zeigen sie nur eine Übereinstimmung von 16 bis 22% in ihren Sequenzen (SAMAL
& ZAMORA, 1991).
In Koexpressionsversuchen mit dem F- und dem G-Protein wurde dem SH-Protein zunächst eine unterstützende Wirkung bei der viralen Fusionsaktivität zugeschrieben (SAMAL &
PASTEY, 1997). Die durch das Fusionprotein bewirkte Synzytienbildung scheint durch SH gesteigert zu sein (HEMINWAY et al., 1994). SH wird allerdings aufgrund von Erkenntnissen mit einem Minigenom-System (TENG & COLLINS, 1998) anders beurteilt.
Hier konnte gezeigt werden, dass das SH-Protein im Grunde keinen Einfluss auf die Vermehrung in der Zellpassage hat, im Gegenteil eher hinderlich zu sein scheint. Es wurde aber gezeigt, dass SH die Bindungsaffinität an Heparinstrukturen erhöhen kann und in dieser Hinsicht die beiden anderen Oberflächenproteine G und F unterstützt (FELDMAN et al., 2001).
Die genaue Funktion des SH-Proteins ist noch nicht bekannt. Rekombinantes RSV, in denen das SH-Gen deletiert wurde, ist in Zellkultur überlebensfähig (BUKREYEV et al., 1997). SH ist also nicht essentiell für das Virus. In vivo ist die SH-Deletionsmutante attenuiert in Bezug auf Schimpansen (WHITEHEAD et al., 1999) und bietet möglicherweise Ansätze zur Entwicklung von Vakzinen.
1.1.6.4 G-Protein
Das Glykoprotein G besitzt eine Transmembranregion am N-Terminus und fällt somit in die Kategorie der Typ-II-Membranproteine. Das relativ hohe Molekulargewicht von 84 bis 90
kDa rührt von der starken Glykosylierung her (MCINTOSH & CHANNOCK, 1985). Es handelt sich zu etwa 80% um O-Glykane, mit denen das G-Protein ausgestattet ist. In einer Nukleotidsequenzanalyse wurde gezeigt, dass zwischen HRSV und BRSV nur eine Homologie von etwa 30% besteht. Obwohl einige Epitope zwischen HRSV und BRSV sehr ähnlich sind, ist die serologische Verwandtschaft sehr verschieden (ORVELL et al., 1987;
BAKER et al., 1992). Antiseren gegen das jeweilige G-Protein der beiden Spezies HRSV und BRSV zeigen keine Kreuzreaktivität (LERCH et al., 1990). Die Divergenz der G-Proteine innerhalb der Spezies HRSV führt zur Einteilung in die Serotypen A und B (JOHNSON et al., 1987).
Die Funktion des G-Proteins liegt in der Bindung an die Wirtszelle (LEVINE et al., 1987). Es stellt den Kontakt zur Zielzelle her und ermöglicht so die weiteren Schritte zur Einschleusung des Virions in den Wirt. Zu den Bindungsproteinen der anderen Paramyxoviren zeigt das Glykoprotein deutliche strukturelle Unterschiede (LANGEDIJK et al., 1996).
Hämagglutinierende Eigenschaften sind nicht vorhanden. Interessant ist die morphologische Ähnlichkeit mit einem Tumornekrose-Faktor-Rezeptor und die damit mögliche immunologische Bedeutung (LANGEDIJK et al., 1998).
Es konnte gezeigt werden, dass die Effektivität der Bindung an die Zielzelle durch Entfernung von zellulären Glukosaminoglykanen stark herabgesetzt werden kann. Außerdem wurde ein Bindungsvermögen des G-Proteins an Heparin festgestellt (KRUSAT & STRECKERT, 1997;
BOURGEOIS et al., 1998). Im RSV-Glykoprotein wurde die Bindungsdomäne für schwefelhaltige heparin-ähnliche Glukosaminoglykane ermittelt (FELDMAN et al., 1999).
Die Affinität von HRSV zu verschiedenen Proteoglykanen kann in folgende Reihenfolge gebracht werden: Heparin – Heparansulfat – Chondroitinsulfat-B (HALLAK et al., 2000). Zu Chondrotitinsulfat-A und –C sowie zu Hyaluronan besteht keine Affinität.
Das Glykoprotein wird in polarisierten Epithelzellen an die apikale Seite transportiert und dort in die Membran integriert (ROBERTS et al., 1995). Neben der membrangebundenen Form gibt es eine weitere Variante. In infizierten Zellen konnte G-Protein nachgewiesen werden, welches keinen zytoplasmatischen Abschnitt und keine Transmembrandomäne
besitzt. Dieses verkürzte G-Protein wird in löslicher Form von den Zellen sezerniert (HENDRICKS et al., 1988; ROBERTS et al., 1994).
Eine Immunantwort mit neutralisierenden Antikörpern richtet sich weniger gegen das G- Protein als vielmehr gegen das Fusionsprotein (SCHRIJVER et al., 1997). Das G-Protein ist nicht essentiell für die Virusvermehrung, wie Versuche mit der attenuierten Deletionsmutante cp-52 erwiesen haben, der sowohl das Gen für SH als auch für G fehlt (KARRON et al., 1997).
1.1.6.5 F-Protein
Nachdem der Kontakt zur Wirtszelle hergestellt ist, wird bei Paramyxoviren eine Fusion der Virusmembran mit der Plasmamembran der betroffenen Zelle eingeleitet. Verantwortlich dafür ist das Fusionsprotein (F-Protein) (BRATT & GALLAGHER, 1969; CHOPPIN &
COMPANS, 1975; WALSH & HRUSKA, 1983).
Am N-Terminus befindet sich ein Signalpeptid für den Transport des Translationskomplexes zur Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER). Weiterhin besitzt das F-Protein neben der Ektodomäne einen Transmembrananker und einen kurzen zytoplasmatischen Abschnitt (COLLINS et al., 1984). Die Aminosäurekette des Fusionsproteins wird in die Membran des ER eingeschleust und mit dem hydrophoben Bereich der Transmembrandomäne in diese verankert.
Das Fusionsprotein hat in seiner monomeren ungespaltenen Form F0 eine Größe von etwa 70 kDa. Modifikationen sind die Acylierung (ARUMUGHAM et al., 1989) und die N- Glykosylierung (CASH et al., 1979; MORRISON, 1988, MALLIPEDDI et al., 1990).
Potentielle N-Glykosylierungsstellen sind N27, N70, N116, N120, N126 und N500 (ZIMMER et al., 2001 a). Des weiteren findet eine Oligomerisierung statt (COLLINS, 1991).
Es kommt zur Ausbildung von Trimeren des F-Proteins (CALDER et al., 2000; MATTHEWS
et al., 2000). Dabei werden haarnadelähnliche Strukturen beobachtet, die möglicherweise die Interaktion mit der Wirtszellmembran verbessern (ZHAO et al., 2000).
Das zunächst gebildete Vorläuferprotein ist noch biologisch inaktiv. Entscheidend zur Erlangung der Fusionsaktivität ist die proteolytische Spaltung in die Untereinheiten F1 und F2
(GRUBER & LEVINE, 1983), die allerdings über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden bleiben (ELANGO et al., 1985). Die Molekulargewichte betragen für F1 48 kDa und für F2 20 kDa. Als Spaltstelle wurde das multibasische Aminosäuremotiv Lysin-Lysin-Arginin-Lysin- Arginin-Arginin (K-K-R-K-R-R) identifiziert, das hinter der Aminosäure 136 von der ubiquitären, d.h. im Grunde in jeder Säugetier-Zelle vorhandenen, Protease Furin gespalten wird (ELANGO et al., 1985). Zusätzlich konnte noch ein weiteres Furinspaltmotiv stromaufwärts entdeckt werden. Es befindet sich an Position 109 und besitzt die Sequenz Arginin-Alanin-Arginin-Arginin (R-A-R-R) (GONZALES-REYES et al., 2001; ZIMMER et al., 2001 b).
Die zweite Spaltstelle ist allerdings nicht essentiell für das Virus. Sie ist entbehrlich für die Replikation und Virusvermehrung in Zellkultur (ZIMMER et al., 2002). In der Elektronenmikroskopie können je nach Spaltung der beiden Motive unterschiedliche strukturelle Ausprägungen des Fusionsproteins beobachtet werden (BEGONA RUIZ- ARGUELLO et al., 2002). Bei der Spaltung an beiden Motiven kommt es zur Heraustrennung eines 27 Aminosäuren großen Peptides, dessen Bedeutung noch nicht hinlänglich geklärt ist.
Außerdem wird durch die Spaltung in die zwei Untereinheiten am N-terminalen Ende der F1- Einheit ein stark hydrophober Bereich, das Fusionspeptid, in eine exponierte Lage gebracht (siehe Abbildung 2). Dieses kann mit der Zielzellmembran wechselwirken und eine Verschmelzung der Lipidschichten der Virusmembran und der Plasmamembran des Wirtes einleiten (COLLINS et al., 2001). So wurde es auch bei anderen Paramyxoviren beobachtet (HSU et al., 1981, KOHAMA et al., 1981).
Abbildung 2: Proteolytische Prozessierung des RSV-Fusionsproteins
Eine Fusion mit der Wirtszelle kann auch allein durch das Fusionsprotein erreicht werden.
Das zeigen Versuche, in denen F in Abwesenheit anderer Oberflächenproteinen exprimiert wurde (PASTEY & SAMAL, 1997). Versuche mit der HRSV-Deletionsmutante cp-52, denen die Genabschnitte für das G- und für das SH-Protein fehlen, zeigen, dass das Fusionsprotein allein, unabhängig von G und SH, eine Replikation in vivo gewährleisten kann (KARRON et al., 1997). Das F-Protein von RSV hat im Gegensatz zu den Fusionsproteinen anderer Paramyxoviren selbst Bindungseigenschaften. Es konnte gezeigt werden, dass RSV mit Heparin-ähnlichen Strukturen interagiert (MARTÌNEZ & MELERO, 2000). Entfernt man Heparin als Bindungspartner enzymatisch, sinkt die Infektiosität der Deletionsmutante cp-52
S-S
Signalpeptid
Membrananker
F2 pep27 F1
Fusionspeptid Furin
zytoplasmatischer Abschnitt
NH
2- -COOH
S-S
Membrananker F1
Fusionspeptid Signalpeptid
F2
zytoplasmatischer Abschnitt
-COOH
NH
2-
sehr stark (FELDMAN et al., 2000). Die F2-Untereinheit kann für die Speziesspezifität verantwortlich gemacht werden (SCHLENDER et al., 2003), d.h. sie bestimmt den Wirt.
Neben der Fusions- und der Bindungseigenschaft hat das F-Protein noch eine weitere Funktion. Es ist das Hauptantigen von RSV und induziert im Wirtsorganismus die Bildung neutralisierender Antikörper (OLMSTEDT et al, 1986; PEMBERTON et al., 1987; WERTZ et al, 1987; KIMMAN & WESTENBRINK, 1990).
1.1.7 Nichtstrukturproteine
Die RNA des respiratorischen Synzytialvirus kodiert für zwei Nichtstrukturproteine. Dies sind das leicht saure, 14 kDa große NS1 und das basische, 15 kDa große NS2. Man kann sie in RSV-infizierten Zellen, nicht aber in Virionen nachweisen (COLLINS et al., 2001). NS2 ist instabil und hat in infizierten Zellen eine Halbwertszeit von etwa 30 Minuten (EVANS et al., 1996). Einzeln oder gemeinsam scheinen sie keinen Effekt auf das self assembly oder auf die Passagierung von Virus-ähnlichen Partikeln zu haben (TENG & COLLINS, 1998). Sie haben offenbar immunologische Bedeutung, denn gemeinsam wirken sie antagonistisch zu Interleukin vermittelten antiviralen Zellantworten (SCHLENDER et al., 2000).
1.1.8 Genomstruktur und Virusvermehrung
Der Kontakt mit der Zielzelle wird durch das G-Protein hergestellt. Dieser Prozess wird als attachment bezeichnet. Das Glykoprotein stellt über eine Bindung an Proteoglykane eine erste Anheftung an die Wirtszelle her. Hierzu beitragen kann wahrscheinlich auch noch das Fusionsprotein mit Hilfe seines Bindungsvermögens an Heparinstrukturen. Nach der Anheftung an den Wirt kann das F-Protein die Fusion einleiten, also die Verschmelzung der Membranen der Zelle und des Viruspartikels. Das Nukleokapsid kann so in das Zytoplasma gelangen, wo im weiteren Transkription und Replikation ablaufen. Diese Vorgänge finden in
vivo insbesondere in den Epithelzellen des Respirationstraktes und in den Alveolarzellen statt.
Eine virämische Ausbreitung erfolgt nicht (SCHRIJVER et al., 1995). Das Genom liegt in einer Länge von 15.222 Basenpaaren vor. Am N-Terminus der RNA befindet sich eine als leader bezeichnete Sequenz, die zwar transkribiert wird, aber nicht für Aminosäuren kodiert.
Als trailer wird ein nichttranskribierter Bereich am 5’-Ende bezeichnet. Zwischen den einzelnen Genabschnitten finden sich ausserdem noch intergenische Nukleotide, kurze, nichttranskribierte Sequenzfolgen (COLLINS et al., 2001).
Abbildung 3: Genomorganisation des respiratorischen Synzytialvirus
Die Genomorganisation von RSV zeigt Abbildung 3. Die RNA dient zum einen der Synthese von mRNA für die 11 verschiedenen Virusproteine mit Hilfe der RNA-abhängigen RNA- Polymerase (L-Protein) (LERCH et al., 1989; WESTENBRINK et al., 1989). Jede mRNA kodiert für jeweils ein Virusprotein. Die einzelnen Gene werden entsprechend ihrer Reihenfolge auf der RNA mit Hilfe des Transkriptionskomplexes aus L, N und P transkribiert, wobei die Menge an produzierter mRNA zum 3’-Ende zunimmt.
Zum anderen dient die RNA der Replikation. Es wird eine durchgehende antigenomische RNA in Positivstrangorientierung synthetisiert, die als Matrize für neue genomische RNA dient. Die Nukleokapsid-Proteine, die sich bereits während der Synthese an das naszierende Genom binden, regulieren die Bildung des Antigenoms. Sie sorgen für die Umschaltung von Transkription auf Replikation.
NS1 NS2 N P M SH G F M2 F
3’ 5’
leader trailer
Unter dem Einfluss des M-Proteins kommt es zum self assembly der Virusbestandteile an der Plasmamembran der Wirtszelle und zum Knospungsprozess (budding), wobei sich das Nukleokapsid als neues Virion an der Lipidhülle der Zelle ausstülpt und abspaltet. Ein Großteil der neuen Viruspartikel bleibt allerdings zellassoziiert, was relativ niedrige Virustiter in Zellkultur zur Folge hat (WECHSLER et al., 1985).
1.2 Das Sendai-Virus 1.2.1 Taxonomie
Das Sendai-Virus (SeV) gehört ebenso wie das respiratorische Synzytialvirus zur Familie Paramyxoviridae. Gemeinsam mit den Virusfamilien Rhabdoviridae, Bornaviridae und Filoviridae bilden sie die Ordnung Mononegavirales, also der Viren mit einem einzelsträngigen Genom in Negativstrangorientierung. Anders als RSV, welches zur Subfamilie der Pneumovirinae gehört, wird das SeV zur Unterfamilie der Paramyxovirinae gerechnet (vgl. Tabelle 1). Hier gruppiert man es gemeinsam mit den humanen Parainfluenzaviren Typ 1 und 3 und dem bovinen Parainfluenzavirus 3 in das Genus Respirovirus ein (CHANOCK et al., 2001).
SeV wird auch als murines, also mausspezifisches, Parainfluenzavirus bezeichnet. Seinen Namen verdankt es seiner Entdeckung in der Stadt Sendai auf der japanischen Hauptinsel Honshu. Der Erreger wurde dort erstmals aus einem an Lungenentzündung verstorbenen Mädchen isoliert (KUROYA & ISHIDA, 1953). Es wurde zunächst für humanpathogen gehalten. Später hat sich allerdings herausgestellt, dass es sich hierbei um einen Zufallsbefund handelte. Es spielt vielmehr in der Heimtier- und Labortierhaltung eine Rolle, insbesondere bei Mäusen und Ratten. Das Sendai-Virus kann als murines Gegenstück zum humanen Parainfluenzavirus 1 angesehen werden. So wird auch das bovine Parainfluenzavirus 3 als Gegenstück zum humanen Parainfluenzavirus 3 betrachtet (ABINANTI et al., 1961; COOK
& CHANOCK, 1963).
1.2.2 Medizinische Bedeutung des Sendai-Virus
Das Sendai-Virus ist weltweit verbreitet und infiziert vorwiegend Kleinnager. Betroffen sind insbesondere Mäuse, Ratten, Hamster und Meerschweinchen (PARKER et al., 1978). Auch Kaninchen sind empfänglich für das Sendai-Virus (MACHII et al., 1989).
In der Heimtiermedizin spricht man im Zusammenhang mit der Sendai-Virus-Infektion vom chronischen respiratorischen Syndrom. Chronische Erkrankungen der Atmungsorgane sind bei zahmen Mäusen die am häufigsten vorgestellten Probleme (VISSIER, 1998). Es handelt sich bei der Infektion mit dem Sendai-Virus teilweise um eine Mischinfektion mit dem Pneumovirus der Maus (PVM), Mycoplasma pulmonis und gelegentlich Mycoplasma neurolyticum. Als bakterielle Sekundärerreger können sich noch Pasteurella pneumotropica, Bordetella bronchiseptica, Corynebacterium kutscheri und andere hinzugesellen.
Tiere, die unter dieser respiratorischen Erkrankung leiden, zeigen eine erschwerte Atmung, die sich durch Schnarchen, Schnauben und Niesen äußert (SPARROW, 1980). Betroffene Tiere sind lustlos, sitzen mit gekrümmtem Rücken und haben ein struppiges Fell. Die Atemnot wird noch durch die deutlich hervortretenden Augen betont (MULLINK, 1979). Der Pathologe kann eine Rhinitis, Bronchitis und Bronchoalveolitis erkennen. Antikörper werden ab dem 7. Tag nachgewiesen und bleiben auf einem hohen Niveau bis zum 21. Tag post infectionem (PERCY & PALMER, 1997).
Das Sendai-Virus verursacht bei der Ratte, ähnlich wie bei der Maus, eher in Jungtieren eine klinisch erkennbare Erkrankung. Die betroffenen Tiere haben Nasenausfluss und eine erschwerte Atmung. Das Wachstum ist vermindert, und das Haarkleid ist stumpf und gesträubt (WIJNBERGEN, 1998). Das Virus kann auch an einer Mischinfektion mit Mycoplasma pulmonis mitwirken und trägt dann zum Krankheitsbild der murinen respiratorischen Mykoplasmose (MRM) bei (HARKNESS & WAGNER, 1989). Diese chronische Form tritt allerdings eher bei älteren Ratten auf (JUDD, 1981). Es wird dabei das klinische Bild einer chronischen progressiven Lungenentzündung hervorgerufen.
In Versuchstierhaltungen ist das Virus problematisch, da die Infektion bei älteren Tieren subklinisch verläuft, aber eventuell Ergebnisse in den Tierversuchen mit infizierten Individuen beeinflussen kann. Das Virus kann sich gewissermaßen in einer Kolonie verstecken. Daher ist es notwendig, in Versuchstierhaltungen regelmäßig auf dieses Virus zu untersuchen (FELASA, 2002). Prophylaktisch isoliert man alle neuabgesetzten Tiere für zwei Monate aus der Kolonie. Ein Totimpfstoff gegen das Sendai-Virus ist im Handel erhältlich (HARKNESS & WAGNER, 1989).
1.2.3 Morphologie
Das Sendai-Virus ist ein behülltes Virus mit helikalem Nukleokapsid. Die Lipiddoppelmembran erhält das Virus durch einen Knospungsprozess an der Plasmamembran der Wirtszelle (KLENK & CHOPPIN, 1969, 1970). Als Oberflächenproteine finden sich in der Virushülle, anders als bei RSV, nur zwei Glykoproteine (vgl. Abbildung 4).
Abbildung 4: schematische Darstellung des Sendai-Virus
L-Protein
N-Protein P-Protein
M-Protein
F-Protein
HN-Protein
Das attachment-Protein des Sendai-Virus ist das Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein (HN- Protein). Das zweite Oberflächenprotein ist das Fusionsprotein (F-Protein). Das Bindeglied zwischen Lipidhülle und Nukleokapsid stellt das Matrixprotein (M-Protein) dar. Die einzelsträngige RNA liegt als Komplex mit 2564 Nukleokapsidproteinen (N-Proteinen) als linksorientierte Helix vor (CALAIN & ROUX, 1993).
Tabelle 3: Funktion und Eigenschaften der SeV-Proteine Protein Molekulargewicht in kDa
/ Modifikationen
charakteristische Eigenschaften und Funktion F0 63
glykosyliert
Vorläuferprodukt, Membranprotein, wird prozessiert zu F1 und F2, ist erst nach dieser Spaltung fusionsaktiv
F1 50-55
glykosyliert, acyliert
carboxyterminale Region von F0, Fusionspeptid am N- Terminus, Typ-I-Membranprotein,
Induktion neutralisierender Antikörper, über Disulfidbrücke mit F2 verbunden
F2 10-12
glykosyliert
aminoterminale Region von F0, Signalpeptid am N- Terminus
HN 69-72
glykosyliert, acyliert
Adsorption, Hämagglutination, Bindung an
Sialinsäuren, Induktion neutralisierender Antikörper, Typ-II-Membranprotein, Neuraminidase
M 39,5 Matrixprotein, bildet Proteinschicht an Membraninnenseite, initiiert self assembly N 58 Nukleokapsidprotein, interagiert mit Genom P 67
phosphoryliert
ergänzt Polymeraseaktivität des L-Proteins, bindet an L- und N-Proteine
L 256 RNA-abhängige RNA-Polymerase
C 23,3 Interferon-Antagonist
D 20 aminoterminal verkürztes C-Protein
V 22-28 phosphoryliert
Insertion von G-Resten durch RNA-Editing bei der Transkription führt zur mRNA für V
Je sechs Nukleotide werden von einem N-Protein gebunden. Bei der Herstellung von rekombinanten Viren stellte man fest, dass es nur zu einer effizienten Replikation von Genomen kommt, wenn die Anzahl an Nukleotiden einem Vielfachen von sechs entspricht („rule of six“). Es werden immer genau sechs Nukleotide vom 5’-Ende der naszierenden RNA-Kette mit einem N-Protein assoziiert. Der RNA-Nukleokapsidprotein-Komplex bildet gemeinsam mit etwa 300 Phosphoproteinen (P) und 20 – 30 large Proteinen (L) das eigentliche Nukleokapsid. Diese Interaktion ermöglicht virale Transkription und Replikation (BUCHHOLZ et al., 1994). Tabelle 3 gibt einen kurzen Überblick über die Strukturproteine und drei der Nichtstrukturpoteine des Sendai-Virus (CHANOCK et al., 2001). Zu den Nukleokapsid-assoziierten Proteinen N, P und L und zu dem Matrixprotein gelten im Grunde genommen die entsprechenden Angaben zum respiratorischen Synzytialvirus.
1.2.4 Oberflächenproteine 1.2.4.1 HN-Protein
Das Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein (HN-Protein) des Sendai-Virus besteht aus 575 Aminosäuren und hat damit ein theoretisches Molekulargewicht von 67 kDa (CHANOCK et al., 2001). Es besitzt vier potentielle N-Glykosylierungsstellen: N77, N448, N 499, N511 (SEGAWA et al., 2003). Die Faltung und Oligomerisierung zu Tetrameren findet im rauhen Endoplasmatischen Retikulum statt (MOTTET et al., 1986). Nahe dem N-Terminus besitzt das HN-Protein eine hydrophobe Region, mit der es in die ER-Membran verankert wird. Ein kurzer Abschnitt verbleibt im Zytoplasma (CHANOCK et al., 2001). Der größte Teil des HN- Proteins bildet die Ektodomäne (Typ-II-Membranprotein). HN liegt als Homotetramer vor und hat in seiner dreidimensionalen Struktur starke Ähnlichkeit zum Neuraminidase-Tetramer des Influenza-A-Virus (THOMPSON et al., 1988).
Ebenso wie das Fusionsprotein des Sendai-Virus induziert HN die Bildung von neutralisierenden Antikörpern im Wirtsorganismus (TAKAO et al., 1997). Zu seinen Funktionen gehören die Bindung (attachment) des Virus an Sialinsäure-haltige Rezeptoren
auf den potentiellen Wirtszellen (WU et al., 1980; MARKWELL et al., 1981, 1984), Neuraminidaseaktivität (GORMAN et al., 1991) und eine fusionsunterstützende Wirkung (LAMB, 1993).
Die Bindungsaffinität zu sialinsäurehaltigen Glykoproteinen oder Glykolipiden ist so hoch, dass HN in der Lage ist, Erythrozyten zu binden und zu agglutinieren. Diese Eigenschaft macht man sich für den Nachweis einer Sendai-Virus-Infektion mit Hilfe des Hämadsorptionstestes oder des Hämagglutinationstestes zunutze (SUZUKI et al., 1983).
Die Hämagglutinin-Neuraminidase ist andererseits auch in der Lage, durch ihre Neuraminidaseaktivität Sialinsäuren von den Rezeptormolekülen abzuspalten (SCHEID &
CHOPPIN, 1974). Damit ist gewährleistet, dass sich neugebildete Virionen von der Wirtszelle abspalten können und nicht die bereits infizierte Zelle reinfizieren. Eine Superinfektion wird also vermieden. Das HN-Protein ist essentiell für ein funktionierendes Fusionsvermögen des F-Proteins (BOUSSE et al., 1994). In Expressionsversuchen konnte die Gruppe um Bousse zeigen, dass es nur bei Koexpression der beiden SeV-Gene HN und F zu einer Zell-Zell- Fusion kommt. Interessanterweise kann auch eine Fusion beobachtet werden bei Koexpression von HN des humanen Parainfluenzavirus 1 und von F des Sendai-Virus.
Umgekehrt (HN von SeV und F von hPIV-1) zeigt sich indes keine Fusion. Es ist hier offenbar eine spezifische Interaktion der beiden Oberflächenproteine vonnöten (BOUSSE et al., 1994).
1.2.4.2 F-Protein
Das Fusionsprotein (F-Protein) besteht in seiner inaktiven Vorläuferform F0, dem primären Translationsprodukt, aus 565 Aminosäuren, besitzt ein theoretisches Molekulargewicht von 63 kDa und enthält drei potentielle Glykosylierungsstellen (BLUMBERG et al., 1985). Die Glykosylierung der zweiten Stelle ist essentiell für den intrazellulären Transport und die Fusionsaktivität des Fusionsproteins (SEGAWA et al., 2000). Zuckerreste werden N- glykosidisch an Asparagin gebunden (YOSHIMA et al., 1981). Am N-Terminus ist ein
hydrophober Bereich zur Einschleusung in das ER zu finden. Dieses Signalpeptid wird nach der Translokation des F-Proteins durch die ER-Membran abgespalten (BLUMBERG et al., 1985).
Das zunächst inaktive Vorläuferprotein F0 (Abbildung 5) wird durch eine wirtsspezifische proteolytische Spaltung zwischen den Aminosäuren 116 und 117 in die Untereinheiten F1 (50- 55 kDa) und F2 (10-12 kDa) geteilt. Beide Peptide bleiben weiterhin über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden (HOMMA & OHUCHI, 1973; SCHEID & CHOPPIN, 1974). Durch die Spaltung und eine Konformationsänderung wird das Fusionspeptid, eine zweite hydrophobe Domäne am N-Terminus des F1-Proteins in eine exponierte Lage gebracht (HSU et al., 1981). In diesem Bereich wird die Fusion der Virushülle mit der Plasmamembran der Zielzelle initiiert (GETHING et al., 1978). Ein dritter hydrophober Bereich am C-Terminus des Fusionsproteins stellt den Membrananker dar, wobei sich das Carboxylende im Zytoplasma befindet. Das Fusionsprotein kann also als Typ-I-Membranprotein eingeordnet werden.
Abbildung 5: Das Fusionsprotein des Sendai-Virus S-S
Signalpeptid Fusionspeptid Membrananker
F2 F1
Trypsin
zytoplasmatischer Abschnitt
NH
2- -COOH
1.2.5 Spaltung des F-Proteins
Die proteolytische Spaltung der Vorläufer-Einheit F0 in die beiden Untereinheiten F1 und F2
ist für die Aktivierung des Virus absolut essentiell. Erst mit der Spaltung des Fusionsproteins ist das Virus in der Lage, mit der Wirtszellmembran zu fusionieren und so in die betroffene Zelle einzudringen. Die verantwortliche Protease, die diese Spaltung bewirkt, ist im Lungengewebe von Mäusen und Ratten, den natürlichen Wirten des Sendai-Virus, lokalisiert (TASHIRO et al., 1990, 1992). Namentlich ist dies die Tryptase Clara, die von bronchialen Epithelzellen in das Lungengewebe abgegeben wird und so die externe Spaltung des SeV- Fusionsproteins gewährleistet. Diese Protease ist vornehmlich im Lungengewebe vorhanden, wodurch sich der strenge Pneumotropismus des Sendai-Virus erklären lässt (TASHIRO &
HOMMA, 1983). Der Infektionsort ist also abhängig von der Anwesenheit aktiver, gewebsspezifischer Proteasen (MOCHIZUKI et al., 1988).
Es konnte allerdings noch eine andere Trypsin-ähnliche Protease identifiziert werden, die zur spezifischen Spaltung des SeV-F befähigt ist. Sie ähnelt dem Blutgerinnungsfaktor X und ist in der Allantoisflüssigkeit von embryonierten Hühnereiern zu finden (MURAMATSU &
HOMMA, 1980). In Zellkultur kann damit eine Aktivierung des Sendai-Virus herbeigeführt werden.
Das SeV-Fusionsprotein hat eine monobasische Spaltstelle mit der Folge –Q-S-R-F-F-. Die Spaltung erfolgt nach dem singulären Arginin (BLUMBERG et al., 1985). Man kann diese Spaltung in Zellkultur durch Zugabe einer exogenen Serin-Protease, wie z.B. Trypsin erreichen (SCHEID & CHOPPIN, 1974). Diese monobasische Spaltstelle ist unter den Paramyxoviren wie auch bei anderen Virusfamilien eher die Ausnahme, wie die Tabelle 4 zeigt (GARTEN et al., 1994). Eine Vielzahl viraler Oberflächenproteine weisen eine multibasische Spaltstelle der Abfolge –(R)-R-X-K/R-R- auf. Wie schon bei RSV ausgeführt, ist dies das Erkennungsmotiv für die ubiquitäre Subtilisin-ähnliche Protease Furin, welche im Golgi-Apparat der meisten Zelltypen zu finden ist (GARTEN et al., 1994; KLENK &
GARTEN, 1994; BOLT & PEDERSEN, 1998).
Tabelle 4: Spaltstellenmotive viraler Glykoproteine
Virus Glykoprotein Spaltstellenmotiv
Paramyxoviridae
Sendai-Virus (Stamm Fushimi)
Newcastle-Disease-Virus (Stamm AV) Masern-Virus
Parainfluenza-Virus Typ 3
F F F F
GVPQSR1 FF GRRQKR FI SRRHKR FA DPRTKR FF Orthomyxoviridae
Influenzavirus A/Memphis/102/72 (H3) Influenzavirus A/Tern/SA/61 (H5)
HA HA
PEKQTR GL TRRQKR GL Flaviviridae
Gelbfieber-Virus M SGRSRR SV
Togaviridae
Sindbis-Virus E2 SGRSKR SV
Retroviridae
Humanes Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) env VQREKR AV Herpesviridae
Epstein-Barr-Virus Varicella-Zoster-Virus
gB gB
LRRRRR DA NTRSRR SV
1:Wichtige basische Aminosäuren des Spaltstellenmotivs sind durch Fettdruck hervorgehoben.
1.2.6 Genomstruktur und Virusvermehrung
Die einzelsträngige, negativorientierte genomische RNA des Sendai-Virus beseht aus 15.384 Nukleotiden. Die Gene für die 6 Strukturproteine sind wie folgt in 5’-Richtung angeordnet:
3’-N-P/C-M-F-HN-L-5’.
Am aminoterminalen Ende des Genoms befindet sich eine leader-Sequenz, die zwar transkribiert wird, jedoch nicht für Aminosäuren kodiert. Am carboxyterminalen Ende liegt eine nicht transkribierte trailer-Sequenz.
Das P/C-Gen kodiert für das Phosphoprotein und sieben Nichtstrukturproteine (C, C’, Y1, Y2, X, V, W). Die Ursache für die Synthese unterschiedlicher Proteine liegt in der Verwendung verschiedener Startkodons und der dadurch entstehenden diversen Leserahmen innerhalb des P/C-Gens (CURRAN & KOLAKOFSKY, 1989, 1990). Das C-Protein wirkt als Interferon- Antagonist und beeinflusst so immunologische Vorgänge innerhalb der Wirtszelle (GARCIN et al., 1999). Außerdem hat das C-Protein die Fähigkeit, Apoptose auszulösen, also den programmierten Zelltod herbeizuführen (ITOH et al., 1998). Die Funktionen der Nichtstrukturproteine sind bisher weitgehend unbekannt, es handelt sich aber vermutlich um regulatorische Funktionen im Bereich der Expression (siehe Tabelle 3) (CHANOCK et al., 2001).
Über das Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein wird der Kontakt mit der Zielzelle hergestellt. Die Adsorption erfolgt an sialinsäurehaltige Rezeptoren auf der Zelloberfläche.
Daraufhin kann das Fusionsprotein, das zuvor durch eine extrazelluläre trypsinähnliche Protease gespalten sein muss, die Verschmelzung der Viruslipidhülle mit der Plasmamembran der zukünftigen Wirtszelle einleiten. Dies geschieht über den hydrophoben Abschnitt am N- terminalen Ende der F1-Untereinheit, der nach der Aktivierung des Fusionsproteins in einer exponierten Stellung ist (OHUCHI & HOMMA, 1976). Somit kann das Nukleokapsid in die Zelle eingeschleust werden (Penetration).
Die Synthese der viralen Komponenten erfolgt im Zytoplasma der infizierten Zelle. Zunächst wird ein primäres Transkript durch die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase synthetisiert.
Von einem Promotor am 5’-Ende werden alle 6 viralen Gene durch einen Polymerasekomplex aus L, N und P transkribiert, und es entstehen 8 polyadenylierte, mit einer 5’-Cap-Struktur versehenen mRNAs. Die intergenischen Sequenzen werden nicht transkribiert. Letztlich liegen die mRNAs der am 3’-Ende transkribierten Gene in größeren Mengen, vor als die mRNAs der Gene, die näher am 5’-Ende kodiert sind. Es entsteht ein Expressionsgradient, ein Regulationsmechanismus für die quantitative Bildung der viralen Proteine (GLAZIER et al., 1977; HOMANN et al., 1990).
Mit zunehmender Zahl der Virusproteine N und P kommt es zur Umschaltung von der Transkription zur Replikation der negativ orientierten RNA. Da bei der Genomreplikation alle Terminations-Signale überlesen werden (VIDAL & KOLAKOFSKY, 1989), wird eine nicht modifizierte, antigenomische RNA mit positiver Polarität gebildet, die von Nukleokapsid- Proteinen verpackt wird.
Die Bindung von Nukleokapsiden an virale Oberflächenproteine erfolgt vermutlich bereits an der intrazellulären Membran des Golgi-Apparates (SANDERSON et al., 1994). Dort interagieren die viralen Transmembranproteine HN und F0 über die zytoplasmatische Domäne mit dem Matrixprotein. Das M-Protein wiederum bindet die Nukleokapside über das N- Protein und wirkt so als Mediator zwischen den Glykoproteinen und dem Nukleokapsid, wodurch möglicherweise auch der Zusammenhalt der reifen Viruspartikel sichergestellt ist (STRICKER et al., 1994).
Der Mechanismus der Ausstülpung der Zellmembran und der Knospung (budding) der Viren ist noch weitgehend ungeklärt. Die Hämagglutinin-Neuraminidase sorgt mit ihrer Neuraminidase-Aktivität für ein Abspalten der Sialinsäuren von der Wirtszelloberfläche und verhindert so eine Reinfektion. Damit wird das Ablösen reifer Viren von der Zelle ermöglicht.
Ein erhöhter Umsatz an M- und HN-Proteinen in der Wirtszelle konnte mit einer starken Reduktion in der Virusausschleusung in Korrelation gebracht werden (ROUX &
WALDVOGEL, 1982; ROUX et al., 1985; TUFFEREAU & ROUX, 1988). Man kann also
vermuten, dass diese Proteine eine entscheidende Rolle bei der Virusausschleusung spielen.
Interessanterweise können temperatursensitive SeV-Mutanten, welche bei nichtpermissiven Temperaturen einen reduzierten HN-Einbau in der Virushülle aufweisen, effizient ausgeschleust werden (STRICKER & ROUX, 1991).
Die Übergänge zwischen den Genen bestehen aus jeweils 50 bis 80 Nukleotiden. In jedem dieser Bereiche findet man eine stark konservierte Region von 22 Nukleotiden, die sich jeweils in drei Abschnitte unterteilen lassen. Die ersten 9 Nukleotide stellen das Terminationssignal des vorangegangenen Gens dar. Die nächsten der Nukleotide werden als intergene Sequenz bezeichnet und nicht transkribiert. Die letzten 10 Nukleotide fungieren als Startsignal für das nachfolgende Gen (GUPTA & KINGSBURY, 1984). Somit ist jeder Genabschnitt von Konsensussequenzen flankiert, welche die Genexpression regulieren.
Das Fusionsprotein von RSV hat im Rahmen der Infektion wichtige Funktionen. Es induziert im Wirtsorganismus die Bildung neutralisierender Antikörper. Weiterhin besitzt es Bindungsvermögen an Heparinstrukturen auf dem Wirt und ist so in der Lage, unabhängig von anderen Oberflächenproteinen, die Infektion zu vermitteln. Schließlich leitet es die Fusion von Virushülle und Plasmamembran der Zielzelle ein. Essentiell für die Funktionstüchtigkeit des Fusionsproteins ist die proteolytische Spaltung durch Furin-ähnliche Proteasen an einem multibasischen Spaltmotiv. Furin ist ubiquitär vorhanden, so dass die Aktivierung von RSV-F in nahezu jeder Zelle, also auch in Zellkultur, erfolgt.
Um einzelne Virusproteine des respiratorischen Synzytialvirus zu untersuchen, greift man meist auf ein Plasmid-Vektor-System zurück, mit dem Einzel- oder Koexpressionen von Virusproteinen durchgeführt werden können (HEMINWAY et al., 1994; PASTEY &
SAMAL, 1997; TENG & COLLINS, 1998).
Als Alternative zu diesem Verfahren wurde ein rekombinantes Sendai-Virus hergestellt, in dessen Genom das Gen für das Fusionsprotein von RSV zusätzlich eingebaut ist. Das entsprechende System wurde vor einigen Jahren im Bereich der SeV-Forschung etabliert, mit dessen Hilfe rekombinante, infektiöse Sendai-Viren aus Plasmid-kodierter cDNA hergestellt werden konnten (GARCIN et al., 1995). Sendai-Viren infizieren Mäuse und andere Kleinnager. Sie besitzen ebenso wie RSV ein Fusionsprotein, welches Antigen- und Fusionseigenschaften besitzt. Es wird allerdings nicht in jeder Zelle gespalten und damit aktiviert. Natürlicherweise wird es außerhalb der Wirtszelle von trypsinähnlichen Proteasen wie der Tryptase Clara in den Lungen von Mäusen aktiviert. In Zellkultur ist es notwendig, exogenes Trypsin bei Infektionsversuchen mit dem Sendai-Virus in das Medium zu geben. Es ist so möglich, bei dem rekombinanten Konstrukt das Sendai-Fusionsprotein nach Belieben durch Trypsin zu aktivieren. Die Infektionswege über das RSV-Fusionsprotein bzw. über das Sendai-Fusionsprotein lassen sich auf diese Weise voneinander unterscheiden. Als Kontrolle wurde anstelle des Gens für RSV-F das Gen für den Farbstoff DsRed eingebaut, welcher in
der Natur von der Scheibenanemone Discosoma ssp. gebildet wird. Dieser Farbstoff wird zytosolisch exprimiert und soll das Sendai-Virus in seiner Funktion nicht beeinträchtigen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, dieses rekombinante Sendai-Virus zu analysieren und die Wirkungsweise des RSV-F im Zusammenhang mit einer SeV-Infektion zu untersuchen, speziell im Hinblick auf die Expression des Fremdgenes und auf dessen Funktionalität (Fusionseigenschaft, Rezeptorbindung). Das zusätzliche Fusionsprotein war ein chimäres Konstrukt, bei dem nur die Ektodomäne dem RSV-Fusionsprotein entstammte, der Transmembrananker und der zytoplasmatische Abschnitt aber dem SeV-Fusionsprotein. Es war zu untersuchen, ob die chimären Anteile des Fusionproteins wichtig waren für den Einbau in Sendai-Virionen.
Der Einbau von Glykoproteinen mit multibasischer Spaltstelle in Sendai-Viren würde außerdem eine Vereinfachung zur Herstellung schwer amplifizierbarer Viren darstellen, da während der Virusvermehrung auf die Zugabe von Trypsin zur Aktivierung des SeV- Fusionsproteins verzichtet werden könnte. Dieser Aspekt wäre eine Hilfe bei der Entwicklung von Sendai-Virus-Vektoren für die Gentherapie. Auch im Hinblick auf einen Tierversuch ist dieses Konstrukt interessant. Es ist denkbar, mit diesem attenuierten Virus Mäuse zu infizieren und damit das RSV-F als Hauptantigen des respiratorischen Synzytialvirus im Mausmodell zu untersuchen. Da das Sendai-Virus kein humanpathogenes Potential besitzt, ist es denkbar, mit ihm RSV-Antigene in einen Wirtsorganismus zur Induktion einer Antikörper- Bildung einzuschleusen. Somit ließen sich weiterhin grundlegende Ergebnisse zur Entwicklung von Impfstoffen ermitteln.
In der vorliegenden Arbeit wurde mit den folgenden permanenten Monolayer-Zelllinien gearbeitet:
Vero-Zellen
Diese Zellen stammen aus dem Nierengewebe der Grünen Meerkatze (African green monkey kidney). Die etablierte Zelllinie wurde vom Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
BHK21-Zellen
Hierbei handelt es sich um eine etablierte Zelllinie aus Nierengewebe von jungen syrischen Goldhamstern (baby hamster kidney). Sie stammt aus der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig. Katalognummer: DSM ACC 61 und wurde durch das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
MDCK-II-Zellen
Ursprünglich stammt diese etablierte Zelllinie aus Nierengewebe von Hunden (Madin Darby Canine Kidney). Auch sie wurde durch das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
3.2 Zellkulturmedien
Medium für VERO-Zellen
Edulb mit Antibiotikazusatz, hergestellt durch das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Hinzugefügt wurde vor Gebrauch 4% Fetales Kälberserum (1 h bei 56°C inaktivert), Fa.
Biochrom KG, Berlin
Medium für BHK21-Zellen bzw. für MDCK-II-Zellen
EMEM (Earl’s Minimum Essential Medium), hergestellt durch das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Hinzugefügt wurde vor Gebrauch 4% Fetales Kälberserum (1 h bei 56°C inaktivert) der Firma Biochrom KG, Berlin.
Methylcellulose-haltiges Medium
In einer 500 ml-Flasche mit einem Magnetrührstab wurden zunächst 4 g Methylcellulose autoklaviert. Dann wurden unter sterilen Bedingungen 500 ml EMEM bzw. Edulb hinzugegeben. Die Zutaten wurden etwa zwei Tage bei 4°C auf einem Magnetrührer miteinander vermengt.
3.3 Erythrozyten
Hühnererythrozyten wurden aus der Klinik für Geflügel, Abteilung Wirtschaftsgeflügel, der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
3.4 Viren
Humanes respiratorisches Synzytialvirus (HRSV)
Der Stamm Long wurde ursprünglich von Herrn Streckert, Universität Bochum, zur Verfügung gestellt.
Rekombinante Sendai-Viren
Der Stamm Fushimi (SeV D 52) wurde von Herrn Prof. Neubert, Max-Planck-Institut für Biochemie, Abteilung Molekulare Virologie, Martinsried, zur Verfügung gestellt.
Die Konstrukte der drei rekombinanten Sendai-Viren rSeV-DsRed, rSeV-RSV-Fch und rSeV- RSV-Fnat (vgl. Abbildung 6) wurden durch Herrn Dr. Zimmer, Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und durch Herrn Dr. Sascha Bossow, Max-Planck- Institut für Biochemie, Abteilung Molekulare Virologie, Martinsried, entwickelt und zur Verfügung gestellt. Die drei Transgene wurden jeweils über die Schnittstellen MlUI und BssHII in das Genom des Sendai-Virus zwischen die Genabschnitte für das P-Protein und für das M-Protein eingebaut. Die Abbildung 6 zeigt ein Schema der Genome für die drei verschiedenen Konstrukte. Die Nukleotidsequenz des chimären Fusionsproteins RSV-Fch des Virus rSeV-RSV-Fch ist im Anhang einzusehen.
Abbildung 6: Schema der Genome der drei rekombinanten Viren
1.) RSeV-RSV-Fch, rekombinantes Sendai-Virus mit Genabschnitt für die Ektodomäne von RSV-F (1), den Transmembrananker (2) und den zytoplasmastischen Abschnitt (3) des Sendai-F
2.) RSeV-RSV-Fnat, rekombinantes Sendai-Virus mit Genabschnitt für das gesamte, native RSV-F
3.) RSeV-DsRed, rekombinantes Sendai.Virus mit Genabschnitt für DsRed, einen Fluoreszenz-Farbstoff der Scheibenanemone Discosoma ssp.
3‘ N P X M F HN L 5‘
RSV-F
3‘ N P X M F HN L 5‘
DsRed
3‘ N P X M F HN L 5‘
1 2 3 RSV-Fch 1.)
2.)
3.)
3.5 Erstantikörper
Anti-RSV-F (Mab Biosoft) Fa. Biosoft, Varilhes, Frankreich
Anti-RSV-F (Mab Melero) zur Verfügung gestellt von Herrn José Antonio Melero, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien
Anti-RSV-F (Mab Örvell) zur Verfügung gestellt von Herrn Claes Örvell, Karolinska Institutet, Department of Microbiology, Pathology + Immunology, Huddinge, Schweden
Anti-RSV-F
(Mab 4, 13, 19) zur Verfügung gestellt von Frau Geraldine Taylor, Institute for Animal Health, Compton, Vereinigtes Königreich
Anti-MBP-F2 zur Verfügung gestellt von Herrn Dr. Zimmer, Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Sendai-Antiserum zur Verfügung gestellt von Herrn Dr. Zimmer, Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Anti-Sendai-HN zur Verfügung gestellt von Herrn Prof. Neubert, Max-Planck- Institut für Biochemie, Abteilung Molekulare Virologie, Martinsried
Anti-Sendai-F zur Verfügung gestellt von Herrn Prof. Neubert, Max-Planck- Institut für Biochemie, Abteilung Molekulare Virologie, Martinsried
Anti-Parainfluenzavirus 1 Fa. DPC Biermann, Bad Nauheim
3.6 Zweitantikörper
Anti-Maus-POD Fa. DAKO, Hamburg
Anti-Maus-FITC Fa. Amersham, Freiburg
Anti-Kaninchen-POD Fa. Sigma, Steinheim
Anti-Kaninchen-FITC Fa. Amersham, Freiburg
3.7 Kits
Silver Stain Kit Fa. BIO-RAD, München
BCA-Protein-Assay Fa. Pierce, Bonn
3.8 Enzyme
Neuraminidase aus V. cholerae Fa. DADE BEHRING, Marburg Trypsin, acyteliert, aus bovinem Pankreas Fa. Sigma, Steinheim
3.9 Substrate/Marker
Rainbow Marker Fa. Amersham, Freiburg
AEC (5-Amino-9-ethylcarbazol) Fa. Sigma, Steinheim BM Chemoluminescence
Blotting Substrate (POD) Fa. Roche, Mannheim
Super Signal® West Dura Extended
Duration Substrate Fa. Pierce, Bonn
3.10 Chemikalien
Acrylamidlösung 30% „rotiphorese® Gel 30“ Fa. Merck, Darmstadt
Aminocapronsäure Fa. Sigma, Steinheim
Amoniumpersulfat (APS) Fa. BIO-RAD, München
Blocking-Reagenz Fa. Roche, Mannheim
Bromphenolblau Fa. Merck, Darmstadt
Calciumchlorid (CaCl2 x 2 H2O) Fa. Roth, Karsruhe Coomassie-Brilliantblau Fa. Merck, Darmstadt 1,4-Diazobicyclo-[2.2.2]-oktan (DABCO) Fa. Sigma, Steinheim 1,4-Dithiotreiol (DTT) Fa. Roth, Karlsruhe Dimethylsulfoxid (DMSO) Fa. Roth, Karlsruhe Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4 x 12 H2O) Fa. Merck, Darmstadt Dimethylformamid (DMF) Fa. Merck, Darmstadt
Essigsäure Fa. Roth, Karlsruhe
Ethanol Fa. Merck, Darmstadt
Fetales Kälberserum (FKS) Fa. Biochrom, Berlin Ganglioside, gereinigt, aus Rinderhirn Fa. Sigma, Steinheim
Glycerin Fa. Roth, Karlsruhe
Glycin Fa. Roth, Karlsruhe
Isopropanol Fa. Roth, Karlsruhe
Kaliumchlorid (KCl) Fa. Roth, Karlsruhe
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Fa. Merck, Darmstadt Magnesiumchlorid (MgCl2 x 6 H2O) Fa. Roth, Karlsruhe Methylcellulose (2.000 centipodes) Fa. Sigma, Steinheim
Mowiol 4-88 Fa. Calbiochem, Darmstadt
Natriumacetat Fa. Merck, Darmstadt
Natriumchlorid (NaCl) Fa. Roth, Karlsruhe
Natriumdodecylsulfat (SDS) Fa. Roth, Karlsruhe N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Fa. Roth, Karlsruhe
Paraformaldehyd Fa. Fluka, Neu-Ulm
Saccharose Fa. Roth, Karlsruhe
Salzsäure Fa. Roth, Karlsruhe
Stickstoff, flüssig Fa. Messer-Griesheim, Krefeld Tris-Hydroxymethylaminmethan (TRIS) Fa. Roth, Karlsruhe
Tween-20 Fa. Roth, Karlsruhe
Wasserstoffperoxid (H2O2), 30% Fa. Merck, Darmstadt
3.11 Puffer und Lösungen
AEC (5-Amino-9-ethylcarbazol)-Lösung (1,85 ml)
AEC-Puffer (0,05 M Natriumacetat, pH 5,0) 1,7 ml AEC-Subtrat
(0,66% AEC in Dimethylformamid (DMF) 0,1 ml
H2O23% 1 Tropfen (0,05 ml)
10 x SDS-Laufpuffer für Polyacrylamidgele
SDS 10 g
TRIS 30 g
Glycin 144 g
Mit H2O auf 1 l aufgefüllt
3% Paraformaldehyd (pH 7,4)
3 g Paraformaldehyd werden in 100 ml PBSM bei 80°C gelöst, steril filtriert und bei –20°C gelagert
2 x SDS-Probenpuffer für Proteingele
TRIS/HCl 100 mM
SDS 4%
Glycerin 20%
Bromphenolblau 0,02%
eingestellt auf pH 6,8
Anodenpuffer I für Semi-Dry-Western-Blot
TRIS/HCl 300 mM
Ethanol 20%
eingestellt auf pH 9,0
Anodenpuffer II für Semi-Dry-Western-Blot
TRIS/HCl 25 mM
Ethanol 20%
eingestellt auf pH 7,4
Kathodenpuffer für Semi-Dry-Western-Blot
TRIS/HCl 25 mM
Ethanol 20%
Aminocapronsäure 40 mM
eingestellt auf pH 9,0
1 M DTT-Lösung
3,09 g DTT wurden in 20 ml einem 0,01 M Natriumacetat-Puffer gelöst.
